ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО НАУКЕ  И ИННОВАЦИЯМ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УНИТАРНОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ 
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
(ФГУП ГОСНИИГЕНЕТИКА)

УДК 579.66
     № гос.регистр.       
      Инв. №                                                                                                   

                                                                       ОТЧЕТ
                                          О  НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ  РАБОТЕ  

                                                                  Этапы I-IV
ФОРМИРОВАНИЕ, СОХРАНЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ НАЦИОНАЛЬНОГО ФОНДА МИКРОБНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ НА БАЗЕ УСУ "ВСЕРОССИЙСКАЯ КОЛЛЕКЦИЯ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ" (ВКПМ), ОБЕСПЕЧИВАЮЩЕГО ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ ПО ПРИОРИТЕТНОМУ НАПРАВЛЕНИЮ  "ЖИВЫЕ СИСТЕМЫ»

                                          (Шифр- 2007-7-1.8-00-04-085    
   Государственный контракт  02.518.11.7053 от  19 апреля 2007 г.)

Руководитель НИР                                                  
д. б. н., проф.       					    __________ С.П. Синеокий
                                                                            
                                                                                       «____» ______________2007 г.

                                                      Москва 2007 

   ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПО СОХРАНЕНИЮ И РАСШИРЕНИЮ КОЛЛЕКЦИОННОГО ФОНДА. ВЫПОЛНЕНИЕ ФУНКЦИЙ НАЦИОНАЛЬНОГО ЦЕНТРА МИКРОБНЫХ БИОРЕСУРСОВ
                                                                      Этап I

Реферат

           МИКРООРГАНИЗМЫ, ШТАММЫ,ПАТЕНТНЫЙ ДЕПОЗИТАРИЙ, ДЕПОНИРОВАНИЕ, ХРАНЕНИЕ, ЛИОФИЛИЗАЦИЯ, КРИОКОНСЕРВАЦИЯ, БАКТЕРИИ, БАЦИЛЛЫ, ГРИБЫ, АКТИНОМИЦЕТЫ, ДРОЖЖИ, ФАГИ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ

Цель работы: Проведение исследований и обеспечение научно-исследовательских, опытно-конструкторских и технологических работ, проводимых организациями Российской Федерации, с предоставлением возможности использования специальных методик; Развитие материально-технической базы УСУ «Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов» (ВКПМ) путем дооснащения приобретаемым научным оборудованием для обеспечения и развития исследований в режиме коллективного пользования.
 За отчетный период в полном объеме выполнены запланированные работы по контролю за состоянием коллекции, обеспечению ее сохранности и развития.   Проведены плановые выборочные проверки жизнеспособности и контролируемых паспортных свойств около 500 коллекционных культур ,  проанализированы стандартные  методики по обеспечению длительной сохранности культур, подготовлены необходимые  повторные закладки на длительное хранение , в т.ч. с использованием лиофилизации и криоконсервации,  обеспечены необходимые режимы хранения коллекционного фонда.  Коллекция пополнилась 151 новым штаммом,  применяемыми в промышленности и в научных исследованиях. 
     Бесперебойное функционирование ВКПМ позволило обеспечивать сохранность и доступность национального фонда коллекционных промышленно-ценных и генетических штаммов, выполнение всех функций национального центра микробных биоресурсов. Обеспечены заявки организаций на коллекционные штаммы и сервисные работы, необходимые, в частности, для реализации ФЦП; осуществлено депонирование микроорганизмов по формам  «хранение»,  « национальное» и «международное»  патентное депонирование. На национальное патентное депонирование принято 77 штаммов, на международное депонирование принят 1 штамм..  По заявкам потребителей из коллекции выдано 858 штаммов, для реализации ФЦП выдано более 100 коллекционных культур. Заключен договор на поставку анаэробной камеры 888-SIMPLICITY/EXP Automatic  Controlled Atmosphere (Anaerobic) фирмы Plas-labs
Обозначения и сокращения
      В настоящем отчете о НИР применяются следующие обозначения и сокращения

ВКПМ - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика
ЦМБР – центр микробных биоресурсов
ГИММ - генно-инженерно-модифицированные  микроорганизмы 
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота  
РНК – рибонуклеиновая кислота

Содержание
                                                                                                                                           Стр.
            Введение   ……………………………………………………………………….6                                                                                                                                     
            1 Функционирование Всероссийской коллекции промышленных  микро-
            организмов………………………………………………………………………8                                                             
1.1 Подготовка методик для проведения работ по поддержанию коллекционного                   фонда и таксономической идентификации культур …………………………..8                                                                                      
                       1.2 Выполнение комплекса  работ по поддержанию и расширению      
                        коллекционного       фонда …………….………………………………………12                                           
1.3 Выполнение сервисных исследований …    ……………………………….18                                                                         
                     1.4  Оценка  эффективности функционирования  ВКПМ……………………..20
1.5	 Заключение договора на закупку оборудования…………………………..21
Заключение       ………………………………………………………..………. 23                                                                                                                                                 Приложение А. Перечень организаций-пользователей УСУ
 Приложение Б. Перечень выполненных сервисных работ 
Приложение В. Перечень стандартных методик по обеспечению 
длительной сохранности культур и их таксономической идентификации на основе анализа ДНК …………..………………………………………………..25

Введение
     Основанием для проведения НИР, выполняемой в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» в  является Государственный контракт от «19» апреля 2007 г. № 02.518.11.7053.
Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) является национальной сервисной коллекцией РФ, на которую, в соответствии с постановлением Совета Министров РФ N725-47 от 24.06.96 г., возложена ответственность за централизацию, обеспечение сохранности и доступности ценных штаммов микроорганизмов, предназначенных для использования в исследовательских и прикладных целях.
Коллекционные фонды ВКПМ, насчитывающие в настоящее время 16331 штамм, формируются в течение 38 лет  за счет наиболее ценных штаммов, создававшихся в отечественных лабораториях и поступавших из-за рубежа. Подавляющее большинство штаммов, созданных в отечественных лабораториях,  поступило в ВКПМ в связи с использованием их в процессах, защищенных авторскими свидетельствами и патентами, или при передаче штаммов для использования на заводах (в период 1968-1992 г.г., в соответствии с существовавшими ведомственными нормативными документами).
     В настоящее время в большинстве промышленно развитых стран накоплен значительный опыт эффективного функционирования крупных национальных коллекций микроорганизмов - Национальных центров микробных биоресурсов (ЦМБР) . ЦМБР стали важным элементом, необходимым для научного и промышленного развития.     Интенсивное развитие биотехнологии связано со все более широким использованием разнообразных штаммов микроорганизмов в научных и прикладных целях.  Современная методология генной инженерии,   быстрое расширение количества секвенированных генов и целых геномов микроорганизмов, растений и животных открывает широкие возможности  к поиску генов, контролирующих самые разнообразные биологические функции, созданию нового поколения эффективных   микробных продуцентов  со значительно более широким спектром синтезируемых промышленно-ценных продуктов    и уникальными практически ценными свойствами. Исследователям, работающим в области биотехнологии, требуется оперативный доступ к  информации о доступных микроорганизмах, сами микроорганизмы, генетические конструкции и  отдельные клонированные гены.  Становятся более актуальными  проблемы, связанные со скринингом природных штаммов, обладающих новыми ценными свойствами, сохранению крупных коллекций подобных штаммов и новых штаммов, созданных в результате научных исследований, обеспечению их доступности для  научной общественности.  Большое внимание в мире привлекает проблема безопасного  использования генетически-модифицированных штаммов. Все более важной становится  проблема   обеспечения защиты прав интеллектуальной собственности на созданные ценные штаммы.
    Качественным отличием создаваемых  ЦМБР от традиционных сервисных и исследовательских коллекций является  то, что их основная  деятельность направлена не только на сохранение и распространение определенного коллекционного фонда, но и  на   решение всего комплекса вопросов формирования определенного раздела национального коллекционного фонда, максимально полное  обеспечение национальных пользователей необходимой информацией о коллекционных биоресурсах (микроорганизмы, генетические конструкции, клонированные гены и т.д.) и самими биоресурсами (независимо от того, где они хранятся); гарантированное выполнение всех правил патентного и иных форм депонирования, которое поручается производить им государственными органами. Важная роль  отводится  ЦМБР в разработке нормативной документации для безопасного использования микроорганизмов,  защиты интеллектуальной собственности на ценные штаммы.   
        Современное состояние науки и промышленности в Российской Федерации во многом определяет задачи, стоящие перед ВКПМ. Прежде всего, это сохранение национального фонда коллекционных штаммов, необходимого для перспективного развития биотехнологии; создание четко работающего механизма централизации, сохранения и обеспечения доступности штаммов, получаемых в отечественных лабораториях и поступающих в РФ из-за рубежа; создание современной нормативной базы работы с промышленно-ценными штаммами;  выполнение функций национального и международного органа по депонированию.  
   Формирование национального коллекционного фонда  и проводимая при этом стандартизация  промышленных  штаммов важны не только для обеспечения потребностей  исследовательских и промышленных  организаций в  коллекционных штаммах, но и  для обеспечения  биобезопасности  использования   штаммов в промышленности и  для обеспечения  защиты прав интеллектуальной собственности на промышленные микроорганизмы. 
Важной проблемой, решаемой в ходе формирования национального коллекционного фонда, является проблема  контроля за распространением промышленных микроорганизмов, в т.ч. ГИММ. 
          1  Функционирование Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов 
    1.1 Подготовка методик для проведения работ по поддержанию коллекционного                 фонда и таксономической идентификации культур.
Поддержание коллекционных фондов ВКПМ обеспечивается выполнением комплекса научных и технологических работ по сохранению и расширению коллекционного фонда ВКПМ, включающего плановые выборочные проверки жизнеспособности коллекционных штаммов, осуществление, в случае необходимости,  повторных закладок на длительное хранение, в т.ч. с использованием лиофилизации и криоконсервации, проведение проверок контролируемых паспортных свойств коллекционных культур и обеспечение необходимых режимов хранения. Сохранность штаммов, хранящихся в коллекции во многом зависит от правильного выбора режима хранения микроорганизмов. В ВКПМ постоянно проводятся исследования по подготовке методик для проведения работ по поддержанию коллекционного фонда. Характеристика используемых методов сохранения и консервации культур приводится ниже.
            А). Метод периодических пересевов
Старый традиционный метод, широко используемый в лабораторной и производственной практике. Метод основан на периодическом 0,5-10 месяцев пересеве хранящихся культур со старых питательных сред на свежие.
Достоинства: Простота, отсутствие специального оборудования.
Недостатки: Трудоемкость, риск заражения культур, возможность нежелательной селекции генетических вариантов или мутантов, приводящей к потере ценных признаков. 
Б) Хранение под минеральным маслом
      Один из наиболее старых способов хранения микроорганизмов. Метод наиболее пригоден для мицелиальных грибов, многие из которых не выдерживают высушивания и замораживания.
Достоинства: Простота в исполнении, не требуется какого-либо специального оборудования.
Недостатки: Биохимические процессы в микроорганизмах, хранящихся под минеральным маслом не прекращаются, а только замедляются. Это может привести к проявлению нежелательных изменений, связанных, например, с продуктивностью штамма. При хранении таким способом с высокой долей вероятности в популяции клеток могут накапливаться менее активные варианты.
В) Высушивание
      Процесс высушивания происходит, как правило, в присутствии обезвоживающего агента (силикагеля, хлористого кальция) под вакуумом без перевода клеток микроорганизмов в жидкое состояние в виде суспензий. Обезвоживание и дальнейшее хранение часто проводят на специальных наполнителях, которые играют роль сорбентов и выполняют защитные функции одновременно. Такими наполнителями могут быть, например, кварцевый песок, фильтровальная бумага, обезвоженный силикагель, фарфоровые шарики и т.д. Метод позволяет сохранять микроорганизмы в жизнеспособном состоянии от нескольких месяцев до нескольких лет.
Достоинства: Простота, отсутствие дорогостоящего оборудования.
Недостатки: Зависимость  от условий предварительного культивирования, длительность самого процесса.
        Г) L-высушивание
   Процесс высушивания суспензии микроорганизмов в защитной среде под вакуумом.
Достоинства: Относительная простота метода, хорошая сохранность микроорганизмов и их положительных свойств, практическое отсутствие изменчивости. Метод особенно хорош для генетически маркированных штаммов и штаммов продуцентов, не переносящих предварительного замораживания.
Недостатки: Требуется специальный подбор ростовых сред, сред для суспензирования и регенерации клеток после хранения.
       Д) Лиофилизация
Высушивание из замороженного состояния под вакуумом. Этот метод является одним из основных при длительном хранении культур микроорганизмов.
Достоинства: Длительность хранения микроорганизмов данным методом в ряде случаев исчисляется десятками лет. Возможность сохранения большого числа микроорганизмов в достаточно компактном виде (стеклянные ампулы).
Недостатки: Зависимость качества сушки от физиологического состояния культуры перед сушкой. Спорообразующие микроорганизмы значительно лучше хранятся в лиофилизированном виде, чем аспорогенные. Крупноклеточные микроорганизмы, особенно эукариоты, часто бывают чувствительными к лиофилизации и плохо ее переносят. Гибель клеток после лиофилизации часто увеличивается в несколько десятков раз. Успех лиофилизации часто зависит от таксономической принадлежности данных микроорганизмов. В ряде случаев имеет место генетическая изменчивость хранящихся культур, что отрицательно сказывается на сохранности их биологических свойств. При низкой выживаемости культур лиофилизация может оказывать селективное действие, при этом будут отбираться клетки наиболее устойчивых вариантов, которые могут и не обладать желаемыми свойствами. Необходимым условием получения хороших результатов при использовании лиофилизации является подработка методики под каждый конкретный штамм-продуцент.
      Е) Хранение при низких температурах (-200С и -700С) в глицерине.
Этот способ длительного хранения широко используется для консервации фактически всех групп микроорганизмов
Достоинства: Простота, легкость исполнения, высокая надежность сохранения жизнеспособности и биосинтетических свойств культур.
Недостатки: Зависимость от технической надежности низкотемпературных холодильников и электросетей.
      Ж) Хранение при сверхнизких температурах. 
     Универсальный метод длительного хранения, применяемый для всех групп микроорганизмов и культур клеток. Обычно суспензии микроорганизмов в 10%  или 15% глицерине хранят в жидком азоте при температуре  -1960С или в его парах при температуре  -1500С . Данный метод хранения общепризнанно является самым надежным способом консервации любых биоматериалов, включая микроорганизмы. Криоконсервация часто является чуть ли не единственным способом хранения микроорганизмов, которые не переносят ни высушивание, ни лиофилизацию. При замораживании для повышения выживаемости микроорганизмов используют различные виды защитных сред, выполняющих функцию криопротекторов. Криопротекторы бывают двух типов. Одни из них, такие как глицерин или диметилсульфоксид, легко проникают через клеточную мембрану клетки, обеспечивая как внутриклеточную защиту от замораживания, так и внеклеточную. Другие соединения, не проникая внутрь клетки, также оказывают защитное действие против образующихся кристалликов льда на наружной поверхности  клеточной мембраны. К таким криопротекторам относятся, например, декстран, крахмал, сахароза, лактоза и т.д. 
Достоинства: Хранение при низких и сверхнизких температурах фактически не изменяет генетические характеристики культур. Неограниченное время хранения микроорганизмов в неизменном виде.
Недостатки: Необходимость в дорогостоящих кельвинаторах и постоянное пополнение резервуаров жидким азотом.
    Наиболее часто для длительного хранения культур используются методы лиофилизации и криоконсервации. Для обеспечения необходимых условий хранения в ВКПМ используются  специальные хранилища. 
 При поступлении культур в коллекцию в ряде случаев перед депонированием  производится идентификация  штаммов методом 16S. Методика идентификации постоянно подрабатывается. Идентификация по 16S в настоящее время является наиболее быстрым, и точным методом идентификации для большинства прокариот. Суть этого метода заключается в определении нуклеотидной последовательности рибосомальных генов  рРНК, полученную последовательность далее сравнивают с помощью специальных компьютерных программ с другими последовательностями из обширной базы данных, по результатам сравнения делают выводы о принадлежности исследуемой бактерии к тому или иному роду или виду. Такой способ идентификации стал возможен благодаря консервативности этих генов. Существуют и другие, аналогичные методы идентификации по другим консервативным последовательностям ДНК, но отсутствие баз данных по этим генам делают их не  эффективными.
Для того, чтобы провести идентификацию по 16S рРНК, необходимо выполнить следующие действия над исследуемым организмом : выделить ДНК, провести полимеразную цепную реакцию со специфическими праймерами, очистить полученный фрагмент ДНК, провести секвенирование фрагмента ДНК  для определения нуклеотидной последовательности, проанализировать полученную последовательность в NCBI Blast или рибосомальной базе данных, по результатам анализа отнести организм к тому или иному роду или виду.
	При выделении ДНК для идентификации по последовательностям рибосомальных генов можно пользоваться любой методикой выделения ДНК для прокариот или эукариот. Обычно признаком хорошего выделения считается, чёткая полоса хромосомы на электрофорезе, но в данном случае это желательно, но не принципиально, поскольку ПЦР является очень чувствительным методом, реакция пройдёт даже, если концентрация ДНК мала или есть примеси, однако, различные примеси могут отрицательно сказаться на выходе реакции.
	Состав типичной ПЦР- реакции представлен ниже.

Таблица 1 Состав типичной ПЦР- реакции
	
Конц.	
Сток	
100µl	

Буферhttp://www.molbiol.ru/protocol/12_01.html - k1#k1	
1х	
10х	
10µl	

MgCl2 (1-4mM)http://www.molbiol.ru/protocol/12_01.html - k2#k2	
2.5mM	
25mM	
10µl	

dNTP’s (50-200µM)http://www.molbiol.ru/protocol/12_01.html - k3#k3	
0.2mM	
10mM	
2.0µl	

Primer#1 & #2http://www.molbiol.ru/protocol/12_01.html - k4#k4	
по 0.1µM	
10µM	
по 1µl	

Polymerasehttp://www.molbiol.ru/protocol/12_01.html - k5#k5	
0.05u/µl	
5u/µl	
1µl	

Матрицаhttp://www.molbiol.ru/protocol/12_01.html - k6#k6	

До 1 ng	

H2O	
 	
mQ	
до 100µl	

При подборе условий для ПЦР часто меняют температуру отжига праймеров, а также изменяют концентрацию различных компонентов реакции, обычно в первую очередь, это концентрация ионов магния. Как известно, ионы магния влияют на специфичность полимеразной цепной реакции : чем больше концентрация магния, тем меньше специфичность. В этом случае появляются посторонние полосы или шлейф вокруг нужной полосы продукта ПЦР при электрофорезе, в то же время, при маленькой концентрации ионов магния выход продукта существенно снижается. Таким образом, при идентификации  приходится варьировать между специфичностью проведённой реакции и выходом продукта.   
	После получения нуклеотидной последовательности фрагмента, проводится сравнение его гомологии с уже имеющимися в базе данных, считается что критерием отнесения к виду является гомология не менее 97%.

1.2 Выполнение комплекса  работ по поддержанию и расширению коллекционного       фонда 
Расширение коллекций проводится  путем осуществления различных форм депонирования ценных штаммов, за счет обмена коллекционными культурами с международными коллекциями. С начала 2007 из международных коллекций получено 26 культур.   Основными формами депонирования в ВКПМ являются  депонирование по форме “хранение”, национальное и международное патентное депонирование, депонирование по форме “гарантийное хранение”. Каждая форма депонирования предусматривает различные правила проверки свойств штаммов, распространения информации о штаммах и выдачи коллекционных культур.
Параллельно с  микробиологическими и  генетическими работами в ВКПМ выполняется большой объем работ по обработке информации о коллекционных штаммах.  На каждый коллекционный штамм оформляются стандартные паспорта, содержащие сведения о происхождении штамма, его  генетических особенностях, о промышленно-ценных качествах, свойствах, влияющих  на оценку уровня риска при работе со штаммом и т.д..  Часть паспортных сведений вносится в закрытую и открытую информационно-поисковые базы данных, а также в компьютерный каталог коллекционных  культур.
Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов представляет ряд коллекций, среди которых: 
а) коллекция промышленно-ценных бактериальных штаммов и коллекция бацилл
Коллекция промышленно-ценных штаммов  и бациллярная коллекция содержат  4265 штаммов. Эти штаммы предназначены для получения нескольких сот различных промышленно-ценных продуктов и для использования во многих технологических процессах.
По запросам организаций выдано 118 штаммов, в том числе 16 выдано по разрешению депозитора и 3 тест-культуры. Это продуценты  закваски кисломолочных продуктов , продуценты ферментов, антибиотиков, типовые штаммы,  и др. 
В коллекцию поступило 63  культуры (компоненты заквасок молочнокислых продуктов , продуценты пробиотиков,  типовые штаммы ), из них 31 штамм депонирован по форме «национальное патентное депонирование», 1 штамм - по форме «международное депонирование», 22 штаммов - по форме «хранение», 10 штаммов – по форме «гарантийное хранение».
За отчетный период в ходе проведенных плановых проверок жизнеспособности и контролируемых свойств проверено  и перезаложено на длительное хранение около 110 культур. 
  Проведена   работа по редактированию и обновлению “Базы данных” и “Каталога  коллекционных  культур”. 
б) коллекция генетически маркированных бактериальных штаммов и бактериальных плазмид.
В настоящее время в коллекции насчитывается 4481 генетически маркированный штамм, в том числе более 1000 штаммов содержат плазмиды. Наиболее широко в коллекции представлены различные мутанты E.coli, а также штаммы бактерий родов Bacillus, Azotobacter, Methilobacillus, Pseudomonas, Streptococcus.
Представленные в коллекции штаммы широко используются в генетических и молекулярно-биологических исследованиях. Многие коллекционные штаммы необходимы для проведения современных фундаментальных и прикладных генно-инженерных работ, в том числе для проектов, проводимых в рамках ФЦП. 
В коллекцию входят также бактериальные промышленно-ценные штаммы, полученные генно-инженерными методами, преимущественно продуценты аминокислот и  ферментов.
Плазмидная коллекция содержит более 1000 различных плазмид, находящихся в штаммах-хозяевах, а также в виде ДНК.  
Коллекция генетически маркированных штаммов и плазмид является самой крупной коллекцией из подобных коллекций в России и одной из крупнейших в мире.
За отчетный период проверена жизнеспособность и контролируемые генетические маркеры 70 штаммов. 62 культуры после проверки размножено и повторно заложено на длительное хранение в лиофилизированном виде.
В коллекцию поступило 37  культур, некоторые из них несут плазмиды, сконструированные в отечественных и зарубежных лабораториях и эффективно использующиеся в современных молекулярно-генетических исследованиях,  35 штаммов депонировано по форме «национальное патентное депонирование», 2 – по форме «гарантийное хранение».
Информация о поступивших штаммах внесена в информационную базу данных.
   По запросам  организаций из коллекции выдано 235 штаммов, из них 207 – тест-культур, 28 – генетически маркированных штаммов.
   в) коллекция грибов
Всего в коллекции насчитывается 958 культур, относящиеся к 118 родам и 255 видам.
За отчетный период в грибную коллекцию поступило 15 культур. Полученные культуры грибов являются продуцентами ферментов, органических кислот , каротиноидов), полиненасыщенных жирных кислот, тест-культурами для проверки грибостойкости различных материалов, антагонистами, применяющимися для биоконтроля фитопатогенных грибов, продуцентами комплекса фитогормонов, использующимися для разработки биоудобрений.
       Проводилась плановая проверка жизнеспособности культур, хранящихся в лиофильно-высушенном виде и под минеральным маслом (есть культуры, которые  погибают при лиофилизации) . Проверена жизнеспособность 85 лиофильно-высушенных культур и хранящихся под минеральным маслом на 3-4 различных средах. Вновь заложено 80 лиофильно-высушенных культур,  под минеральное масло на 2-х питательных средах заложено 65 культур. 
В коллекцию поступило 15  культур, из них 1 штамм депонирован по форме «национальное патентное депонирование», 4 штамма - по форме «хранение» и 10 – «гарантийное хранение».
Проводилась  работа по редактированию и обновлению “Базы данных” и  
 “Каталога  коллекционных  культур”. 
В 2007 г. по запросам различных организаций выдано 13 культур, в том числе 2 тест-культуры, 11 штаммов -  для прикладных и исследовательских целей.
г) коллекция штаммов-продуцентов ферментов нуклеинового обмена и коллекция тест -культур чувствительности к различным антибиотикам.
Коллекция ферментов продуцентов нуклеинового обмена и тест-культур насчитывает 532 культуры. Коллекция включает в себя эндонуклеазы рестрикции , ферменты нуклеинового обмена; тест-культуры на антибиотики, аминокислоты, витамины, дезинфицирующие средства и т.д.: 11 штаммов сине-зеленых водорослей, 2 культуры зеленых водорослей.
За отчетный период в ходе проведенных плановых проверок жизнеспособности и контролируемых свойств проверено  и перезаложено на длительное хранение 100 культур, в том числе 40 тест-культур.
По запросам организаций выдано 305 культур, из них 290 – тест-культур, 15 – для прикладных целей.
В коллекцию поступило 6 культур, депонированных по форме  «хранение».
Проводилась  работа по редактированию и обновлению “Базы данных” и  
   “Каталога  коллекционных  культур”. 
д) коллекция дрожжей
Коллекция дрожжей насчитывает 3263 штаммов. Среди коллекционных штаммов продуценты нескольких десятков различных промышленно-ценных продуктов и штаммы, применяющиеся в  различных биотехнологических процессах, используемых в медицинской и пищевой промышленности, сельском хозяйстве и других областях. 
Дрожжевая коллекция ВКПМ близка по размеру и составу крупным национальным коллекциям США (АТСС), Германии (DSM), Англии (NCYC), Японии (IFO). В дрожжевой коллекции ВКПМ представлено много уникальных штаммов, предназначенных для использования в различных областях биотехнологии.  Коллекция  дрожжей представляет как научный, так и практический интерес для  поиска продуцентов новых промышленно-ценных веществ. 
Проведена плановая проверка жизнеспособности и контролируемых коллекционных свойств и повторная закладка на длительное хранение 70 штаммов дрожжей.
Из коллекции выдано 16 штаммов дрожжей, из них 7 тест-культур и 9 - для производственных и научных целей, в том числе 4 выдано по разрешению депозитора.
В 2007 г. в коллекцию поступило 22  культуры, из них 4 штамма депонировано по форме «национальное патентное депонирование», 12 штаммов - по форме «хранение», 6 штаммов – по форме «гарантийное хранение».
Полученные культуры внесены в электронную «Базу данных».
е) Коллекция актиномицетов
Коллекция актиномицетов включает 1743 культур. Культуры, входящие в состав коллекции, находят широкое применение в практической деятельности человека как продуценты  антибиотиков медицинского и ветеринарного назначения, ферментов, полисахаридов, липидов, нуклеотидов, пигментов, кислот. Представители рода Bifidobacterium используются в качестве  заквасок различных кисломолочных продуктов, продуцентов молочной и уксусной кислот и др. Коллекция включает более 200 типовых штаммов, а также ряд тест-культур для определения активности антибиотиков и др. биологически активных веществ. 
За отчетный период в коллекцию поступило 7 культур актиномицетов , из них 6 штаммов депонировано по форме «национальное патентное депонирование», 1 - по форме «гарантийное хранение».
   Проведена плановая проверка жизнеспособности, чистоты и контролируемых свойств 40 культур, заложенных на хранение в лиофильно-высушенном виде. Все культуры повторно заложены на хранение.
По запросам различных организаций выдано 23 культуры для прикладных и исследовательских целей.
.ж) коллекция бактериофагов
Фаговая коллекция насчитывает 1089 генетически модифицированных модельных бактериофагов, предназначенных для использования в исследовательских целях, а также набор трансдуцирующих бактериофагов (более 500 штаммов), содержащих фрагменты ДНК, перекрывающие полностью хромосому наиболее хорошо генетически изученного объекта молекулярно-генетических исследований - бактерии E.coli). Помимо этих фагов поддерживается коллекция фагов, специфических более чем для 20 видов промышленно-ценных микроорганизмов (многие из них выделены в процессе фаголиза на производствах). Создана коллекция фагов, специфических  практически ко всем рецепторам E.coli, а также коллекция  бактериальных лизогенов E.coli по различным умеренным фагам. Эти коллекции эффективно используются, в частности, в ходе работ по созданию фагоустойчивых продуцентов на основе E.coli.
В коллекции продолжается работа по распространению нитчатых фагов, используемых в качестве тест - штаммов для санитарно - микробиологического анализа питьевой воды на водопроводных станциях России. 
За отчетный период проведена проверка жизнеспособности и контролируемых свойств 15 бактериофагов, с последующей лиофилизацией и перезакладкой 10 фагов. 
Из коллекции выдано 148 тест-культур бактериофагов.
Коллекция гибридом содержит 103 гибридомы. 
1.2 	Выполнение функций национального и международного органа по депонированию    микроорганизмов.
В течение отчетного периода  ВКПМ строго выполняла все правила, установленные для работы ВКПМ в качестве национального и международного патентного депозитария микроорганизмов.
ВКПМ письменно и устно проводила консультации по различным вопросам, 
связанным с депонированием микроорганизмов, в том числе по правовым вопросам, касающимся процедуры депонирования и выдачи штаммов, возможности использования полученных штаммов, а также норм Будапештского договора.
Проводилась работа по выявлению информации о защищенности депонированных штаммов авторскими свидетельствами СССР, патентами России и др. стран. 
Всего с начала  2007 г. в  ВКПМ  принят 151 штамм, в том числе 77 культур депонировано по форме «национальное патентное депонирование», 1- «международное патентное депонирование» . В соответствии с действующими правилами распространения коллекционных культур выдано 858 штаммов, в том числе для реализации ФЦП выдано более 100 коллекционных культур микроорганизмов. Всего в коллекции поддерживается  16331 культур.
Статистические данные приема/выдачи штаммов ВКПМ представлены в таблицах 2-4.
Таблица 2    Штаммы, выданные из ВКПМ, депонированные по форме “хранение” 

Использование 	Количество выданных штаммов	
Генетические исследования 	28	
Тест- культуры	 657	
 Использование в прикладных целях	  153	

Таблица 3                Штаммы, выданные из ВКПМ, депонированные по форме иной, чем “хранение” 

Форма депонирования	Количество выданных штаммов	Основание  для выдачи	
Национальное патентное	 20	Разрешение депозитора	
Международное патентное	 -	Нормы Будапештского договора	
Гарантийное хранение	-	-	

Таблица 4                      Штаммы, поступившие в ВКПМ 

Форма депонирования	Количество штаммов	
Хранение	                     44	
Национальное патентное депонирование	                     77	
Международное патентное депонирование	                      1	
Гарантийное хранение	                       29	

    
 
1.3 Выполнение сервисных исследований 

Выполнение разнообразных сервисных работ, связанных с использованием коллекционных микроорганизмов в исследовательских и практических целях, является важной стороной деятельности национальных сервисных коллекций. Эта функция вытекает из важной задачи, стоящей перед этими коллекциями - не только централизовать и сохранить ценные штаммы микроорганизмов, но и способствовать  их изучению  и эффективному использованию. Обладая возможностями осуществлять работу с широким кругом микроорганизмов и обрабатывать большие объемы информации о коллекционных штаммах, сервисные коллекции обычно помогают заинтересованным организациям в освоении методов работы с этими культурами, проверке их свойств, работе с информационными базами данных, дают разнообразные консультации по депонированию и патентной защите промышленно-ценных штаммов.
   За отчетный период в ВКПМ  для сторонних организаций проведено:
   - более 40 консультаций по работе с коллекционными штаммами, касающимися культивирования микроорганизмов,  различных форм депонирования микроорганизмов;
  -20 работ  по идентификации штаммов  микроорганизмов до вида  с помощью анализа 16S РНК;   
  -  8 работ по паспортизации штаммов путем ДНК фингерпринта  микроорганизмов с использованием метода ПЦР; 
- 1 научно-практическая стажировка аспиранта Кубанского аграрного университета. Целью стажировки являлось освоение практических навыков современных методов по таксономической и штаммовой идентификации микроорганизмов на основе ПЦР, а также теоретических сведений: теоретические основы таксономической идентификации микроорганизмов по последовательностям генов 16S 18S рРНК (бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы), методы выделения суммарной ДНК клетки, электрофореза, ПЦР, анализа первичных последовательностей ДНК с использованием компьютерных программ (Chromas, BLAST, рибосомальной базы данных, применение Vector NTI для этих целей), построение филогенетических деревьев, дополнительное использование других консервативных последовательностей при идентификации близкородственных микроорганизмов, использование ДНК фингерпринта на основе RAPD ПЦР для сравнения штаммов.
- научно-практические практикумы для студентов  Университета Пищевой биотехнологии, Университета Пищевых производств и Московского государственного университета, с последующим прохождением преддипломной практики и подготовкой дипломной работы.
Получено  26 культур из международных коллекций.

      1.4  Оценка  эффективности функционирования ВКПМ
         
     Оценка  эффективности функционирования ВКПМ в качестве уникальной установки основывается на значении исследовательских и прикладных работ, в которых использовались штаммы, полученные из ВКПМ, и для выполнения которых требовалось   выполнение сервисных  работ на базе ВКПМ.
    В отчетный период объем штаммов, выдаваемых из ВКПМ   для использования в исследовательских и прикладных целях  составил 858.   Около 30% выдаваемых штаммов  используются исследовательскими организациями в ходе выполнения  НИР по приоритетным направлениям научных исследований.  Около 15 % выдаваемых штаммов взяты для  непосредственного  использования  на промышленных биотехнологических предприятиях,  включая  предприятия пищевой биотехнологии. Около 50%  выданных  штаммов используются для   исследований  по контролю экологии окружающей среды,  проверки качества продуктов. Около  5% -  в качестве стандартов при проведении микробиологических исследований.
    ВКПМ  активно  участвует в  различных исследовательских проектах как на этапах штаммовой и таксономической идентификации штаммов микроорганизмов, так и на этапе патентования штаммов и процессов их использования,   осуществляя национальное и патентное депонирование штаммов ( в качестве национального и международного патентного депозитария). ВКПМ участвует в следующих контрактах: 
1.	«Альтернатива антибиотикам – лизоцимы бактерий»;
2.	Реконструкция метаболизма бактерий с помощью сенсорных РНК и получение на этой основе штаммов-продуцентов;
3.	Lux-биосенсоры для мониторинга окружающей среды: детекция токсических веществ в воздухе, воде, почве, пищевых продуктах;
4.	Разработка научных основ нанотехнологии для создания биосовместимых материалов медицинского назначения на базе рекомбинантных аналогов белков паутины;
5.	Производство рекомбинантных белков для медицинского применения на основе культур клеток животных и микроорганизмов с использованием высокоэффективных технологических платформ   
        ВКПМ участвует в международном проекте «Биологический контроль сине-зеленых водорослей» в рамках Межправительственного соглашения по научно-техническому сотрудничеству с КНР.
1.6	Заключение договора на закупку оборудования
       Обоснование приобретения анаэробной камеры 888-SIMPLICITY/EXP Automatic  Controlled Atmosphere (Anaerobic) фирмы Plas-labs
      В последнее время в ВКПМ возникла потребность в совершенствовании базы для культивирования анаэробных микроорганизмов. Это обусловлено расширением тематики,  в первую очередь активизацией исследований по биотехнологии сольвентогенных клостридиев – продуцентов бутанола, работа  с которыми на современном уровне требует проведения серьезных и длительных генетических и биохимических экспериментов. Кроме того, в коллекции имеется ряд штаммов-анаэробов, надежность поддержания которых также в значительной степени определяется уровнем соответствующего оборудования. Коллекция периодически получает запросы от организаций-заказчиков на культуры практически важных анаэробных бактерий (обитатели рубца жвачных, десульфобактерии и т.д.) и  приобретает их в других коллекциях, причем эти культуры сильно различаются по специфике культивирования (чувствительность к кислороду, потребность в газовых смесях определенного состава, большой диапазон оптимальных для роста температур и т.д.). 
      Современная микробиологическая анаэробная технология основывается на следующих методических принципах:
1). Вся микробиологическая работа с культурами – от пересева до пересева – должна проводиться полностью в анаэробных условиях;
2). Отбор, хранение и обработка проб также должны осуществляться в условиях, не допускающих контакта с молекулярным кислородом;
3). Природные образцы  и чистые культуры  должны высеваться на предварительно восстановленные среды. Термическую стерилизацию сред необходимо проводить в отсутствие молекулярного кислорода, с тем, чтобы в средах не образовывались перекисные соединения и супероксидные радикалы;
4). Ряд биохимических исследований анаэробных микроорганизмов, особенно при изучении их ферментов, коферментов, мембран, должны также выполняться в строго анаэробных условиях. 
       В настоящее время имеется арсенал совершенных методов и оборудования для   культивирования анаэробов как в жидких, так и на плотных питательных средах. В основе этих методов лежат разработки Хангейта, сутью которых являются: 
-  Работа с организмами в токе нейтрального газа или смеси газов, очищенных от кислорода;  - Эффективная очистка газов с помощью высокоэффективных катализаторов реакции кислорода и водорода (гранулированной меди или палладия). 
     Для пересевов и культивирования анаэробов на плотных питательных средах разработаны и выпускаются различными фирмами специальные перчаточные анаэробные боксы и камеры, атмосфера в которых очищается от О2 с помощью палладиевого катализатора, а материалы подаются в камеры с помощью шлюзов.
    К числу наиболее разработанных и эффективных типов анаэробоксов принадлежит модель 888-SIMPLICITY/EXP фирмы Plas-labs. Она отличается компактными размерами (102,5 х 70 х 65 см) и полностью укомплектована для работы. Прибор включает программируемый блок контроля с дисплеем, причем контроль ряда параметров (состав и давление инертного газа, температура и т.д.) после установки осуществляется автоматически. Имеются такие важные блоки и функции, как модуль удаления следов кислорода,  осушительная цепь (вакуумный насос входит в комплект), функции подвода газа и термостатирования камеры до 42оС (что позволяет использовать его и как анаэробный термостат), второй диафрагменный вакуумный насос для шлюзовой камеры, освещение обычным светом и флуоресцентная лампа. В качестве дополнительных,  необходимых для надежной и безопасной работы аксессуаров предлагаются  измеритель и регулятор скорости потока инертного газа, заглушки для отсоединения перчаток и запасные перчатки, вспомогательная система удаления кислорода и  беспламенная горелка-стерилизатор для работы в анаэробных условиях, а также полки, значительно увеличивающие полезную площадь бокса. 
   Преимуществами боксов фирмы Plas-labs, в частности данной модели, могут считаться следующие характеристики:
1. Базовая комплектация включает все необходимое оборудование;
2. Высокая степень автоматизации и надежности узлов, удобный набор дополнительных аксессуаров, расширяющих диапазон возможностей прибора;
3. Дизайн, обеспечивающий компактные размеры в сочетании с большой рабочей поверхностью;
4. Удобная обтекаемая форма прибора позволяет, с одной стороны, эффективно и компактно вписать его в интерьер лаборатории, а с другой стороны,  легко очистить и простерилизовать внутреннюю поверхность;
5. Сравнительно невысокая стоимость для приборов такого класса (у других фирм подобная модель в соответствующей комплектации стоит не менее 950 тыс. руб.);
6. Возможность быстрой пуско-наладки без привлечения сотрудников фирмы, легкость в эксплуатации.  
 С фирмой ООО «Аналит-Универсал» заключен договор № 70532-1 от 28 мая 2007 г. на поставку ФГУП ГосНИИгенетике анаэробокса. 
                                                        Заключение
      За отчетный период   выполнены все работы , предусмотренные   планом  проекта «Формирование, сохранение и изучение национального фонда микробных генетических ресурсов на базе УСУ "Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов" (ВКПМ), обеспечивающего проведение исследований по приоритетному направлению "Живые системы». В целях контроля за состоянием коллекции проведена плановая проверка  жизнеспособности и контролируемых  свойств около 500 коллекционных штаммов.  В коллекцию принят 151 штамм микроорганизмов, в том числе 77 штаммов принято на национальное патентное депонирование и 1 – на международное патентное депонирование. Полученные культуры представляют интерес для использования в прикладных  и исследовательских целях . Все поступившие  в коллекцию штаммы прошли необходимую проверку и заложены на длительное хранение с использованием   современных технологий лиофилизации и криоконсервации. 
 Бесперебойное функционирование ВКПМ в качестве национальной сервисной коллекции, выполняющей функции национального и международного патентного депозитария,  позволяет обеспечивать сохранность и доступность национального фонда коллекционных промышленно-ценных и генетически-маркированных  штаммов, обеспечивать  возможность  национальной и международной защиты прав интеллектуальной собственности на промышленно-ценные штаммы микроорганизмов. По поводу предоставления штаммов и выполнения различных сервисных исследований в коллекцию обратилось более 200 организаций. По заявкам потребителей из коллекции выдано 858 штаммов микроорганизмов, для реализации ФЦП выдано более 100 коллекционных культур. С фирмой ООО «Аналитик-Универсал» заключен договор на поставку анаэробной камеры 888-SIMPLICITY/EXP Automatic  Controlled Atmosphere (Anaerobic) фирмы Plas-labs
Перечень организаций-пользователей УСУ, перечень выполненных сервисных работ; перечень стандартных методик по обеспечению длительной сохранности культур и их таксономической идентификации на основе анализа ДНК приведены в Приложениях.

Этап II

 ВЫПОЛНЕНИЕ ФУНКЦИЙ НАЦИОНАЛЬНОГО ЦЕНТРА МИКРОБНЫХ БИОРЕСУРСОВ. ОБЕСПЕЧЕНИЕ СОХРАННОСТИ И РАСШИРЕНИЯ КОЛЛЕКЦИОННОГО ФОНДА ВКПМ. РАЗВИТИЕ ИНФОРМАЦИОННО-ПОИСКОВОЙ БАЗЫ ДАННЫХ О КОЛЛЕКЦИОННЫХ ШТАММАХ

Реферат
           МИКРООРГАНИЗМЫ, ШТАММЫ,ПАТЕНТНЫЙ ДЕПОЗИТАРИЙ, ДЕПОНИРОВАНИЕ, ХРАНЕНИЕ, ЛИОФИЛИЗАЦИЯ, КРИОКОНСЕРВАЦИЯ, БАКТЕРИИ, БАЦИЛЛЫ, ГРИБЫ, АКТИНОМИЦЕТЫ, ДРОЖЖИ, ФАГИ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ

Цель работы: Проведение исследований и обеспечение научно-исследовательских, опытно-конструкторских и технологических работ, проводимых организациями Российской Федерации, с предоставлением возможности использования специальных методик; Развитие материально-технической базы УСУ «Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов» (ВКПМ) путем дооснащения приобретаемым научным оборудованием для обеспечения и развития исследований в режиме коллективного пользования.
 За отчетный период в полном объеме выполнены запланированные работы по контролю за состоянием коллекции, обеспечению ее сохранности и развития.   Проведены плановые выборочные проверки жизнеспособности и контролируемых паспортных свойств около 636 коллекционных культур ,  подготовлены необходимые  повторные закладки на длительное хранение , в т.ч. с использованием лиофилизации и криоконсервации,  обеспечены необходимые режимы хранения коллекционного фонда.  Коллекция пополнилась 253 новым штаммом,  применяемыми в промышленности и в научных исследованиях. 
     Бесперебойное функционирование ВКПМ позволило обеспечивать сохранность и доступность национального фонда коллекционных промышленно-ценных и генетических штаммов, выполнение всех функций национального центра микробных биоресурсов. Обеспечены заявки организаций на коллекционные штаммы и сервисные работы, необходимые, в частности, для реализации ФЦП; осуществлено депонирование микроорганизмов по формам  «хранение»,  « национальное» и «международное»  патентное депонирование. На национальное патентное депонирование принято 78 штаммов, на международное депонирование принят 1 штамм..  Вся информация о депонируемых штаммах стандартизирована и введена в информационно-поисковую базу данных.  По заявкам потребителей из коллекции выдано 825 штаммов, для реализации ФЦП выдано более 100 коллекционных культур. Продолжено оснащение уникальной установки научным оборудованием. 
Обозначения и сокращения
      В настоящем отчете о НИР применяются следующие обозначения и сокращения

ВКПМ - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика
ЦМБР – центр микробных биоресурсов
ГИММ - генно-инженерно-модифицированные  микроорганизмы 
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота  
РНК – рибонуклеиновая кислота

Содержание
                                                                                                                                           Стр.
            Введение   ……………………………………………………………………….6                                                                                                                                     
            1 Функционирование Всероссийской коллекции промышленных  микро-
            организмов………………………………………………………………………8                                            
                         1.1 Выполнение комплекса  работ по поддержанию и расширению      
                        коллекционного       фонда ……………………………………..8                                                                          
                          1.2 Выполнение сервисных исследований …    …………………………...15                                                                         
                         1.3  Оценка  эффективности функционирования  ВКПМ………………..16
  Заключение       ………………………………………………………..……. 17                                                                                                                                                 

Введение
     Основанием для проведения НИР, выполняемой в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» в  является Государственный контракт от «19» апреля 2007 г. № 02.518.11.7053.
Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) является национальной сервисной коллекцией РФ, на которую, в соответствии с постановлением Совета Министров РФ N725-47 от 24.06.96 г., возложена ответственность за централизацию, обеспечение сохранности и доступности ценных штаммов микроорганизмов, предназначенных для использования в исследовательских и прикладных целях.
Коллекционные фонды ВКПМ, насчитывающие в настоящее время 16584 штаммов, формируются в течение 38 лет  за счет наиболее ценных штаммов, создававшихся в отечественных лабораториях и поступавших из-за рубежа. Подавляющее большинство штаммов, созданных в отечественных лабораториях,  поступило в ВКПМ в связи с использованием их в процессах, защищенных авторскими свидетельствами и патентами, или при передаче штаммов для использования на заводах (в период 1968-1992 г.г., в соответствии с существовавшими ведомственными нормативными документами).
     В настоящее время в большинстве промышленно развитых стран накоплен значительный опыт эффективного функционирования крупных национальных коллекций микроорганизмов - Национальных центров микробных биоресурсов (ЦМБР). ЦМБР стали важным элементом, необходимым для научного и промышленного развития.     Интенсивное развитие биотехнологии связано со все более широким использованием разнообразных штаммов микроорганизмов в научных и прикладных целях.  Современная методология генной инженерии,   быстрое расширение количества секвенированных генов и целых геномов микроорганизмов, растений и животных открывает широкие возможности  к поиску генов, контролирующих самые разнообразные биологические функции, созданию нового поколения эффективных   микробных продуцентов  со значительно более широким спектром синтезируемых промышленно-ценных продуктов    и уникальными практически ценными свойствами. Исследователям, работающим в области биотехнологии, требуется оперативный доступ к  информации о доступных микроорганизмах, сами микроорганизмы, генетические конструкции и  отдельные клонированные гены.  Становятся более актуальными  проблемы, связанные со скринингом природных штаммов, обладающих новыми ценными свойствами, сохранению крупных коллекций подобных штаммов и новых штаммов, созданных в результате научных исследований, обеспечению их доступности для  научной общественности.  Большое внимание в мире привлекает проблема безопасного  использования генетически-модифицированных штаммов. Все более важной становится  проблема   обеспечения защиты прав интеллектуальной собственности на созданные ценные штаммы.
    Качественным отличием создаваемых  ЦМБР от традиционных сервисных и исследовательских коллекций является  то, что их основная  деятельность направлена не только на сохранение и распространение определенного коллекционного фонда, но и  на   решение всего комплекса вопросов формирования определенного раздела национального коллекционного фонда, максимально полное  обеспечение национальных пользователей необходимой информацией о коллекционных биоресурсах (микроорганизмы, генетические конструкции, клонированные гены и т.д.) и самими биоресурсами (независимо от того, где они хранятся); гарантированное выполнение всех правил патентного и иных форм депонирования, которое поручается производить им государственными органами. Важная роль  отводится  ЦМБР в разработке нормативной документации для безопасного использования микроорганизмов,  защиты интеллектуальной собственности на ценные штаммы.   
        Современное состояние науки и промышленности в Российской Федерации во многом определяет задачи, стоящие перед ВКПМ. Прежде всего, это сохранение национального фонда коллекционных штаммов, необходимого для перспективного развития биотехнологии; создание четко работающего механизма централизации, сохранения и обеспечения доступности штаммов, получаемых в отечественных лабораториях и поступающих в РФ из-за рубежа; создание современной нормативной базы работы с промышленно-ценными штаммами;  выполнение функций национального и международного органа по депонированию.  
   Формирование национального коллекционного фонда  и проводимая при этом стандартизация  промышленных  штаммов важны не только для обеспечения потребностей  исследовательских и промышленных  организаций в  коллекционных штаммах, но и  для обеспечения  биобезопасности  использования   штаммов в промышленности и  для обеспечения  защиты прав интеллектуальной собственности на промышленные микроорганизмы. 
Важной проблемой, решаемой в ходе формирования национального коллекционного фонда, является проблема  контроля за распространением промышленных микроорганизмов, в т.ч. ГИММ. 
          1  Функционирование Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов 
1.1 Выполнение комплекса  работ по поддержанию и расширению коллекционного       фонда 
Расширение коллекций проводится  путем осуществления различных форм депонирования ценных штаммов, за счет обмена коллекционными культурами с международными коллекциями. За отчетный период из международных коллекций получено 91 культура.   Основными формами депонирования в ВКПМ являются  депонирование по форме “хранение”, национальное и международное патентное депонирование, депонирование по форме “гарантийное хранение”. Каждая форма депонирования предусматривает различные правила проверки свойств штаммов, распространения информации о штаммах и выдачи коллекционных культур.
Параллельно с  микробиологическими и  генетическими работами в ВКПМ выполняется большой объем работ по обработке информации о коллекционных штаммах.  На каждый коллекционный штамм оформляются стандартные паспорта, содержащие сведения о происхождении штамма, его  генетических особенностях, о промышленно-ценных качествах, свойствах, влияющих  на оценку уровня риска при работе со штаммом и т.д..  Часть паспортных сведений вносится в закрытую и открытую информационно-поисковые базы данных, а также в компьютерный каталог коллекционных  культур.
Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов представляет ряд коллекций, среди которых: 
а) коллекция промышленно-ценных бактериальных штаммов и коллекция бацилл
Коллекция промышленно-ценных штаммов  и бациллярная коллекция содержат  4324 штаммов. Эти штаммы предназначены для получения нескольких сот различных промышленно-ценных продуктов и для использования во многих технологических процессах.
 За отчетный период были получены следующие культуры:
Bacillus amyloliquefaciens - продуценты альфа-амилазы; инозина, гуанозина, типовой штамм; Bacillus thuringiensis – продуцент эндотоксина; Bacillus subtilis используется для профилактики и лечения дерматомикозов, вызываемых грибами;  Brevibacillus laterosporus ; Bacillus subtilis  - продуцент рибофлавина;   типовой штамм;   типовой штамм;  Bacillus circulans -типовой штамм;  Bacillus coagulans - типовой штамм;  Bacillus megaterium - типовой штамм;  Paenibacillus polymyxa - типовой штамм; Bacillus brevis - типовой штамм; Paenibacillus macerans - типовой штамм, Bacillus thuringiensis - типовой штамм;  Propionibacterium freudenrichii - продуцент жирных кислот, витамина В12, используется в защите от микробной порчи пищевых и сельскохозяйственных  продуктов, пробиотик;  Lactobacillus sakei;  Lactobacillus paracasei.
  По запросам организаций выдано 136 штаммов, в том  числе  выдано 117 промышленно-ценных штаммов, 3  - по Будапештскому договору, 3 – по разрешению депозитора и 19 тест-культур. Это культуры, входящие в закваски кисломолочных продуктов , продуценты ферментов, антибиотиков, типовые штаммы,  и др. 
В коллекцию поступило 49  культур (компоненты заквасок молочнокислых продуктов , продуценты пробиотиков,  типовые штаммы ), из них 19 штаммов депонировано по форме «национальное патентное депонирование»,  30 штаммов - по форме «хранение», 10 штаммов – по форме «гарантийное хранение».
За отчетный период в ходе проведенных плановых проверок жизнеспособности и контролируемых свойств проверено  и перезаложено на длительное хранение около 139 культур. 
  Проведена   работа по редактированию и обновлению “Базы данных” и “Каталога  коллекционных  культур”. 
б) коллекция генетически маркированных бактериальных штаммов и бактериальных плазмид.
В настоящее время в коллекции насчитывается 4575 генетически маркированный штамм, в том числе более 1000 штаммов содержат плазмиды. Наиболее широко в коллекции представлены различные мутанты E.coli, а также штаммы бактерий родов Bacillus, Azotobacter, Methilobacillus, Pseudomonas, Streptococcus.
Представленные в коллекции штаммы широко используются в генетических и молекулярно-биологических исследованиях. Многие коллекционные штаммы необходимы для проведения современных фундаментальных и прикладных генно-инженерных работ, в том числе для проектов, проводимых в рамках ФЦП. 
В коллекцию входят также бактериальные промышленно-ценные штаммы, полученные генно-инженерными методами, преимущественно продуценты аминокислот и  ферментов.
Плазмидная коллекция содержит более 1000 различных плазмид, находящихся в штаммах-хозяевах, а также в виде ДНК.  
Коллекция генетически маркированных штаммов и плазмид является самой крупной коллекцией из подобных коллекций в России и одной из крупнейших в мире.
За отчетный период проверена жизнеспособность и контролируемые генетические маркеры 100 штаммов. 73 культуры после проверки размножено и повторно заложено на длительное хранение в лиофилизированном виде.
В коллекцию поступило 94  культуры, некоторые из них несут плазмиды, сконструированные в отечественных и зарубежных лабораториях и эффективно использующиеся в современных молекулярно-генетических исследованиях,  47 штаммов депонировано по форме «национальное патентное депонирование», 47 – по форме «хранение».
Информация о поступивших штаммах внесена в информационную базу данных.
   По запросам  организаций из коллекции выдано 227 штаммов, из них 203 – тест-культуры, 24 – генетически маркированных штаммов.
  
          в) коллекция грибов
Всего в коллекции насчитывается 979 культур. Культуры грибов являются продуцентами ферментов, органических кислот , каротиноидов), полиненасыщенных жирных кислот, тест-культурами для проверки грибостойкости различных материалов, антагонистами, применяющимися для биоконтроля фитопатогенных грибов, продуцентами комплекса фитогормонов, использующимися для разработки биоудобрений.
       За отчетный период в грибную коллекцию поступили следующие культуры:  Fomitopsis officinalis – продуцент биологически активных веществ – иммуномодуляторов, Aspergillus foetidus – продуцент пектиназы, Asp. awamori – продуцент 1,4-бета-эндоксиланазы; Asp. carbonarius   -  
продуцент лимонной и глюконовой кислот, Asp. carbonarius  - ферментов целлюлазы и лигниназы и пигмента меланина; Asp. nidulans  - продуцент целлюлазы и гемицеллюлазы;
Asp. niger – продуцент лимонной кислоты, ферментов липазы, пектиназы и инулиназы;
Asp. phoenicis – продуцент бета-глюканазы;Asp. terreus – продуцент итаконовой кислоты;
Asp. terreus – продуцент итаконовой и итатартаровой кислот; Sporotrichum thermophile – продуцент термостабильной глюкоамилазы; Alternaria alternata – фитопатоген, тест-культура для оценки фунгицидов; Hormoconis resinae - тест-культура для оценки биоповреждений ряда субстратов; Penicillium aurantiogriseum – продуцент пенициллиновой кислоты; 
Pen. brevicompactum – типовой штамм, продуцент эргостерина;    Pen. funiculosum - тест-культура для оценки биоповреждений ряда субстратов;    Paecilomyces variotii - тест-культура для оценки биоповреждений ряда субстратов.
       Проводилась плановая проверка жизнеспособности культур, хранящихся в лиофильно-высушенном виде и под минеральным маслом (есть культуры, которые  погибают при лиофилизации) . Проверена жизнеспособность 97 лиофильно-высушенных культур и хранящихся под минеральным маслом на 3-4 различных средах: - из ампул (лиофильно- высушенных)  - 56 штаммов;  хранящихся под вазелиновым маслом – 35 штаммов;  из кельвинатора (-70оС, 10 % глицерин) – 6 штаммов (Blakeslea trispora).
В коллекцию поступила 21  культура, из них 2 штамма депонировано по форме «национальное патентное депонирование», 19 штаммов - по форме «хранение».
Проводилась  работа по редактированию и обновлению “Базы данных” и  
 “Каталога  коллекционных  культур”. 
За отчетный период по запросам различных организаций выдано 19 культур, в том числе 6 тест-культур, 13 штаммов -  для прикладных и исследовательских целей.
г) коллекция штаммов-продуцентов ферментов нуклеинового обмена и коллекция тест -культур чувствительности к различным антибиотикам.
Коллекция ферментов продуцентов нуклеинового обмена и тест-культур насчитывает 543 культуры. Коллекция включает в себя эндонуклеазы рестрикции , ферменты нуклеинового обмена; тест-культуры на антибиотики, аминокислоты, витамины, дезинфицирующие средства и т.д.: 11 штаммов сине-зеленых водорослей, 2 культуры зеленых водорослей.
За отчетный период в ходе проведенных плановых проверок жизнеспособности и контролируемых свойств проверено  и перезаложено на длительное хранение 88 культур, в том числе 39 тест-культур.
По запросам организаций выдано 225 культур, из них 220 – тест-культур, 5 – для прикладных целей.
В коллекцию поступило:  Pantoea ananatis – продуценты     цистеина  ,     Shewanella oneidensis  - типовой штамм;     Shewanella oneidensis -типовой штамм, Aeromonas hydrophila,    Aeromonas hydrophila  - типовой штамм,     Aminobacter aminovorans  -типовой штамм.
 8 культур, депонированных по форме  «национальное депонирование» и 3 - «гарантийное хранение».
Проводилась  работа по редактированию и обновлению “Базы данных” и  
   “Каталога  коллекционных  культур”. 
д) коллекция дрожжей
Коллекция дрожжей насчитывает 3324 штамма. Среди коллекционных штаммов продуценты нескольких десятков различных промышленно-ценных продуктов и штаммы, применяющиеся в  различных биотехнологических процессах, используемых в медицинской и пищевой промышленности, сельском хозяйстве и других областях. 
Дрожжевая коллекция ВКПМ близка по размеру и составу крупным национальным коллекциям США (АТСС), Германии (DSM), Англии (NCYC), Японии (IFO). В дрожжевой коллекции ВКПМ представлено много уникальных штаммов, предназначенных для использования в различных областях биотехнологии.  Коллекция  дрожжей представляет как научный, так и практический интерес для  поиска продуцентов новых промышленно-ценных веществ. 
За отчетный период в коллекцию поступили следующие культуры: Saccharomyces cerevisiae - продуценты РНК; S. chevalieri, S. ernobii, S. fermentati, S. Italicus, S. prostoserdovii, S. telluris, S. uvarum – культуры, используемые в виноделии; S. cerevisiae - продуцент глютатиона; S. cerevisiae – культуры, используемые в виноделии; Schizosaccharomyces pombe – продуценты этанола; Schwanniomyces occidentalis - продуценты амилазы, инулазы; Yarrowia lipolyttica продуцент липазы.
Проведена плановая проверка жизнеспособности и контролируемых коллекционных свойств и повторная закладка на длительное хранение 120 штаммов дрожжей.
Из коллекции выдано 61 штамм дрожжей, из них 8 тест-культур и 53 - для производственных и научных целей.
За отчетный период в коллекцию поступило 44  культуры, из них  27 штаммов депонировано по форме «хранение», 17 штаммов – по форме «гарантийное хранение».
Полученные культуры внесены в электронную «Базу данных».
е) Коллекция актиномицетов
Коллекция актиномицетов включает 1763 культур. Культуры, входящие в состав коллекции, находят широкое применение в практической деятельности человека как продуценты  антибиотиков медицинского и ветеринарного назначения, ферментов, полисахаридов, липидов, нуклеотидов, пигментов, кислот. Представители рода Bifidobacterium используются в качестве  заквасок различных кисломолочных продуктов, продуцентов молочной и уксусной кислот и др. Коллекция включает более 200 типовых штаммов, а также ряд тест-культур для определения активности антибиотиков и др. биологически активных веществ. 
За отчетный период в коллекцию поступили следующие культуры: типовые штаммы
Bifidobacterium saeculari;   Bifidobacterium subtili;   Bifidobacterium pseudolongum; Bifidobacterium gallicum; Bifidobacterium minimum;  Bifidobacterium coryneforme; Bifidobacterium magnum; Bifidobacterium cuniculi.  Культуры выделены из разных источников и могут быть использованы в качестве пробиотиков и в составе заквасок для кисломолочных продуктов.  Arthrobacter atrocyaneus - типовой штамм;  Arthrobacter aurescens - типовой штамм, продуцент копропорфирина 111;  Arthrobacter citreus - типовой штамм, продуцент серина,  тест-культура на субтилин;  Arthrobacter globiformis - типовой штамм, продуцент копропорфирина 111;  Arthrobacter oxidans - типовой штамм, продуцент копропорфирина 111 и уропорфирина 111;  Arthrobacter ramosus - типовой штамм, продуцент копропорфирина 111.
Всего получено 20 культур актиномицетов, все они депонированы по форме «хранение».
   Проведена плановая проверка жизнеспособности, чистоты и контролируемых свойств 92 культур, заложенных на хранение в лиофильно-высушенном виде. Все культуры повторно заложены на хранение.
По запросам различных организаций выдано 17 культур для прикладных и исследовательских целей.
ж) коллекция бактериофагов
Фаговая коллекция насчитывает 1090 генетически модифицированных модельных бактериофагов, предназначенных для использования в исследовательских целях, а также набор трансдуцирующих бактериофагов (более 500 штаммов), содержащих фрагменты ДНК, перекрывающие полностью хромосому наиболее хорошо генетически изученного объекта молекулярно-генетических исследований - бактерии E.coli). Помимо этих фагов поддерживается коллекция фагов, специфических более чем для 20 видов промышленно-ценных микроорганизмов (многие из них выделены в процессе фаголиза на производствах). Создана коллекция фагов, специфических  практически ко всем рецепторам E.coli, а также коллекция  бактериальных лизогенов E.coli по различным умеренным фагам. Эти коллекции эффективно используются, в частности, в ходе работ по созданию фагоустойчивых продуцентов на основе E.coli.
В коллекции продолжается работа по распространению нитчатых фагов, используемых в качестве тест - штаммов для санитарно - микробиологического анализа питьевой воды на водопроводных станциях России. 
За отчетный период проведена проверка жизнеспособности и контролируемых свойств 40 бактериофагов, с последующей лиофилизацией и перезакладкой 20 фагов. 
Из коллекции выдано 140 тест-культур бактериофагов.
Коллекция гибридом содержит 105 гибридом. За отчетный период получено 2 новых гибридом. 
1.2 	Выполнение функций национального и международного органа по депонированию    микроорганизмов.
В течение отчетного периода  ВКПМ строго выполняла все правила, установленные для работы ВКПМ в качестве национального и международного патентного депозитария микроорганизмов.
ВКПМ письменно и устно проводила консультации по различным вопросам, 
связанным с депонированием микроорганизмов, в том числе по правовым вопросам, касающимся процедуры депонирования и выдачи штаммов, возможности использования полученных штаммов, а также норм Будапештского договора.
Проводилась работа по выявлению информации о защищенности депонированных штаммов авторскими свидетельствами СССР, патентами России и др. стран. 
За отчетный период в  ВКПМ  принято 253 штамма, в том числе 78 культур депонировано по форме «национальное патентное депонирование», 1- «международное патентное депонирование» . В соответствии с действующими правилами распространения коллекционных культур выдано 825 штаммов, в том числе для реализации ФЦП выдано более 100 коллекционных культур микроорганизмов. Всего в коллекции поддерживается  16584 культуры.
Статистические данные приема/выдачи штаммов ВКПМ представлены в таблицах 1-3.
Таблица 1    Штаммы, выданные из ВКПМ, депонированные по форме “хранение” 

Использование 	Количество выданных штаммов	
Генетические исследования 	24	
Тест- культуры	 596	
 Использование в прикладных целях	  200	

Таблица 2                Штаммы, выданные из ВКПМ, депонированные по форме иной, чем “хранение” 

Форма депонирования	Количество выданных штаммов	Основание  для выдачи	
Национальное патентное	 2	Разрешение депозитора	
Международное патентное	 3	Нормы Будапештского договора	
Гарантийное хранение	-	-	

Таблица 3                      Штаммы, поступившие в ВКПМ 

Форма депонирования	Количество штаммов	
Хранение	                     144	
Национальное патентное депонирование	                     78	
Международное патентное депонирование	                      1	
Гарантийное хранение	                       30	

    
 
1.2 Выполнение сервисных исследований 

Выполнение разнообразных сервисных работ, связанных с использованием коллекционных микроорганизмов в исследовательских и практических целях, является важной стороной деятельности национальных сервисных коллекций. Эта функция вытекает из важной задачи, стоящей перед этими коллекциями - не только централизовать и сохранить ценные штаммы микроорганизмов, но и способствовать  их изучению  и эффективному использованию. Обладая возможностями осуществлять работу с широким кругом микроорганизмов и обрабатывать большие объемы информации о коллекционных штаммах, сервисные коллекции обычно помогают заинтересованным организациям в освоении методов работы с этими культурами, проверке их свойств, работе с информационными базами данных, дают разнообразные консультации по депонированию и патентной защите промышленно-ценных штаммов.
   За отчетный период в ВКПМ  для сторонних организаций проведено:
   - более 45 консультаций по работе с коллекционными штаммами, касающимися культивирования микроорганизмов,  различных форм депонирования микроорганизмов;
  -22 работы  по идентификации штаммов  микроорганизмов до вида  с помощью анализа 16S РНК для сторонних организаций;   
  -  9 работ по паспортизации штаммов путем ДНК фингерпринта  микроорганизмов с использованием метода ПЦР; 
- 1 научно-практическая стажировка сотрудников фирмы ООО «Промышленные инновации. Целью стажировки являлось освоение практических навыков современных методов по таксономической и штаммовой идентификации микроорганизмов на основе ПЦР, а также теоретических сведений: теоретические основы таксономической идентификации микроорганизмов по последовательностям генов 16S 18S рРНК (бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы), методы выделения суммарной ДНК клетки, электрофореза, ПЦР, анализа первичных последовательностей ДНК с использованием компьютерных программ (Chromas, BLAST, рибосомальной базы данных, применение Vector NTI для этих целей), построение филогенетических деревьев, дополнительное использование других консервативных последовательностей при идентификации близкородственных микроорганизмов, использование ДНК фингерпринта на основе RAPD ПЦР для сравнения штаммов.
- научно-практические практикумы для студентов  Университета Пищевой биотехнологии, Университета Пищевых производств и Московского государственного университета, с последующим прохождением преддипломной практики и подготовкой дипломной работы.
Получена  91 культура из международных коллекций.

      1.3  Оценка  эффективности функционирования ВКПМ
         
     Оценка  эффективности функционирования ВКПМ в качестве уникальной установки основывается на значении исследовательских и прикладных работ, в которых использовались штаммы, полученные из ВКПМ, и для выполнения которых требовалось   выполнение сервисных  работ на базе ВКПМ.
    В отчетный период объем штаммов, выдаваемых из ВКПМ   для использования в исследовательских и прикладных целях  составил 825.   Около 30% выдаваемых штаммов  используются исследовательскими организациями в ходе выполнения  НИР по приоритетным направлениям научных исследований.  Более 15 % выдаваемых штаммов взяты для  непосредственного  использования  на промышленных биотехнологических предприятиях,  включая  предприятия пищевой биотехнологии. Более 50%  выданных  штаммов используются для   исследований  по контролю экологии окружающей среды,  проверки качества продуктов,  в качестве стандартов при проведении микробиологических исследований.
    ВКПМ  активно  участвует в  различных исследовательских проектах как на этапах штаммовой и таксономической идентификации штаммов микроорганизмов, так и на этапе патентования штаммов и процессов их использования,   осуществляя национальное и патентное депонирование штаммов ( в качестве национального и международного патентного депозитария). ВКПМ участвует в следующих контрактах, в том числе в ВИП-проекте: 
6.	«Разработка продуцентов липазы для ферментных препаратов заместительной терапии»;
7.	 «Альтернатива антибиотикам – лизоцимы бактерий»;
8.	Реконструкция метаболизма бактерий с помощью сенсорных РНК и получение на этой основе штаммов-продуцентов;
9.	Lux-биосенсоры для мониторинга окружающей среды: детекция токсических веществ в воздухе, воде, почве, пищевых продуктах;
10.	Разработка научных основ нанотехнологии для создания биосовместимых материалов медицинского назначения на базе рекомбинантных аналогов белков паутины;
11.	Производство рекомбинантных белков для медицинского применения на основе культур клеток животных и микроорганизмов с использованием высокоэффективных технологических платформ  
            ВКПМ участвует в международном проекте «Биологический контроль сине-зеленых водорослей» в рамках Межправительственного соглашения по научно-техническому сотрудничеству с КНР.
                              Заключение
      За отчетный период   выполнены все работы , предусмотренные   планом  проекта «Формирование, сохранение и изучение национального фонда микробных генетических ресурсов на базе УСУ "Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов" (ВКПМ), обеспечивающего проведение исследований по приоритетному направлению "Живые системы». В целях контроля за состоянием коллекции проведена плановая проверка  жизнеспособности и контролируемых  свойств 636 коллекционных штаммов.  В коллекцию принят 253 штамма микроорганизмов, в том числе 78 штаммов принято на национальное патентное депонирование и 1 – на международное патентное депонирование. Полученные культуры представляют интерес для использования в прикладных  и исследовательских целях . Все поступившие  в коллекцию штаммы прошли необходимую проверку и заложены на длительное хранение с использованием   современных технологий лиофилизации и криоконсервации. 
 Бесперебойное функционирование ВКПМ в качестве национальной сервисной коллекции, выполняющей функции национального и международного патентного депозитария,  позволяет обеспечивать сохранность и доступность национального фонда коллекционных промышленно-ценных и генетически-маркированных  штаммов, обеспечивать  возможность  национальной и международной защиты прав интеллектуальной собственности на промышленно-ценные штаммы микроорганизмов. По поводу предоставления штаммов и выполнения различных сервисных исследований в коллекцию обратилось  более 135 организаций. По заявкам потребителей из коллекции выдано 825 штаммов микроорганизмов, для реализации ФЦП выдано более 100 коллекционных культур. Подготовлен электронный каталог ВКПМ-2007. Продолжено оснащение ВКПМ современным оборудованием и приборами.

Этап Ш

 ВЫПОЛНЕНИЕ ФУНКЦИЙ НАЦИОНАЛЬНОГО ЦЕНТРА МИКРОБНЫХ БИОРЕСУРСОВ. ВЫВОЛНЕНИЕ КОМПЛЕКСА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ, ГЕНЕТИЧЕСКИХ, ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ И ИНФОРМАЦИОННЫХ РАБОТ ПО ПОДДЕРЖАНИЮ И РАСШИРЕНИЮ КОЛЛЕКЦИОННОГО ФОНДА  ВКПМ.

           МИКРООРГАНИЗМЫ, ШТАММЫ, ПАТЕНТНЫЙ ДЕПОЗИТАРИЙ, ДЕПОНИРОВАНИЕ, ХРАНЕНИЕ, ЛИОФИЛИЗАЦИЯ, КРИОКОНСЕРВАЦИЯ, БАКТЕРИИ, БАЦИЛЛЫ, ГРИБЫ, АКТИНОМИЦЕТЫ, ДРОЖЖИ, ФАГИ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ

Цель работы: Проведение исследований и обеспечение научно-исследовательских, опытно-конструкторских и технологических работ, проводимых организациями Российской Федерации, с предоставлением возможности использования специальных методик; Развитие материально-технической базы УСУ «Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов» (ВКПМ) путем дооснащения приобретаемым научным оборудованием для обеспечения и развития исследований в режиме коллективного пользования.
 За отчетный период в полном объеме выполнены запланированные работы по контролю за состоянием коллекции, обеспечению ее сохранности и развития.   Проведены плановые выборочные проверки жизнеспособности и контролируемых паспортных свойств около 696 коллекционных культур,  подготовлены необходимые  повторные закладки на длительное хранение , в т.ч. с использованием лиофилизации и криоконсервации,  обеспечены необходимые режимы хранения коллекционного фонда.  Коллекция пополнилась 168 новым штаммом,  применяемым в промышленности и в научных исследованиях. 
     Бесперебойное функционирование ВКПМ позволило обеспечивать сохранность и доступность национального фонда коллекционных промышленно-ценных и генетических штаммов, выполнение всех функций национального центра микробных биоресурсов. Обеспечены заявки организаций на коллекционные штаммы и сервисные работы, необходимые, в частности, для реализации ФЦП; осуществлено депонирование микроорганизмов по формам  «хранение»,  « национальное» и «международное»  патентное депонирование. На национальное патентное депонирование принято 89 штаммов, на международное депонирование принят 1 штамм.  Вся информация о депонируемых штаммах стандартизирована и введена в информационно-поисковую базу данных.  По заявкам потребителей из коллекции выдано 1117 штаммов, для реализации ФЦП выдано более 110 коллекционных культур. Продолжено оснащение уникальной установки научным оборудованием. 

Обозначения и сокращения
      В настоящем отчете о НИР применяются следующие обозначения и сокращения

ВКПМ - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика
ЦМБР – центр микробных биоресурсов
ГИММ - генно-инженерно-модифицированные  микроорганизмы 
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота  
РНК – рибонуклеиновая кислота

Содержание
                                                                                                                                           Стр.
   Введение   ……………………………………………………………………………..6                                                                                                                                     
   1 Функционирование Всероссийской коллекции промышленных  микро-
      организмов…………………………………………………………………………...8                                            
                1.1 Выполнение комплекса  работ по поддержанию и расширению      
                        коллекционного       фонда ………………………………………8 
              1.2 Выполнение функций национального и международного органа 
    по        депонированию    микроорганизмов…………………………………….13
              1.3 Выполнение сервисных исследований …    …………………………................15                                                           
               1.4  Оценка  эффективности функционирования  ВКПМ…………………………16                                                                                                                                                                                       
                2 Разработка  правил  работ  с коллекционными  генно-инженерными 
                    штаммами (правила  депонирования ГИММ в ВКПМ)……………………….17
                   Заключение       ………………………………………………………..………. ..24                 

Введение
     Основанием для проведения НИР, выполняемой в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы»   является Государственный контракт от «19» апреля 2007 г. № 02.518.11.7053.
Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) является национальной сервисной коллекцией РФ, на которую, в соответствии с постановлением Совета Министров РФ N725-47 от 24.06.96 г., возложена ответственность за централизацию, обеспечение сохранности и доступности ценных штаммов микроорганизмов, предназначенных для использования в исследовательских и прикладных целях.
Коллекционные фонды ВКПМ, насчитывающие в настоящее время 16752 штамма, формируются в течение почти 40  лет  за счет наиболее ценных штаммов, создававшихся в отечественных лабораториях и поступавших из-за рубежа. Подавляющее большинство штаммов, созданных в отечественных лабораториях,  поступило в ВКПМ в связи с использованием их в процессах, защищенных авторскими свидетельствами и патентами, или при передаче штаммов для использования на заводах (в период 1968-1992 г.г., в соответствии с существовавшими ведомственными нормативными документами).
     В настоящее время в большинстве промышленно развитых стран накоплен значительный опыт эффективного функционирования крупных национальных коллекций микроорганизмов - Национальных центров микробных биоресурсов (ЦМБР). ЦМБР стали важным элементом, необходимым для научного и промышленного развития.     Интенсивное развитие биотехнологии связано со все более широким использованием разнообразных штаммов микроорганизмов в научных и прикладных целях.  Современная методология генной инженерии,   быстрое расширение количества секвенированных генов и целых геномов микроорганизмов, растений и животных открывает широкие возможности  к поиску генов, контролирующих самые разнообразные биологические функции, созданию нового поколения эффективных   микробных продуцентов  со значительно более широким спектром синтезируемых промышленно-ценных продуктов    и уникальными практически ценными свойствами. Исследователям, работающим в области биотехнологии, требуется оперативный доступ к  информации о доступных микроорганизмах, сами микроорганизмы, генетические конструкции и  отдельные клонированные гены.  Становятся более актуальными  проблемы, связанные со скринингом природных штаммов, обладающих новыми ценными свойствами, сохранению крупных коллекций подобных штаммов и новых штаммов, созданных в результате научных исследований, обеспечению их доступности для  научной общественности.  Большое внимание в мире привлекает проблема безопасного  использования генетически-модифицированных штаммов. Все более важной становится  проблема   обеспечения защиты прав интеллектуальной собственности на созданные ценные штаммы.
    Качественным отличием создаваемых  ЦМБР от традиционных сервисных и исследовательских коллекций является  то, что их основная  деятельность направлена не только на сохранение и распространение определенного коллекционного фонда, но и  на   решение всего комплекса вопросов формирования определенного раздела национального коллекционного фонда, максимально полное  обеспечение национальных пользователей необходимой информацией о коллекционных биоресурсах (микроорганизмы, генетические конструкции, клонированные гены и т.д.) и самими биоресурсами (независимо от того, где они хранятся); гарантированное выполнение всех правил патентного и иных форм депонирования, которое поручается производить им государственными органами. Важная роль  отводится  ЦМБР в разработке нормативной документации для безопасного использования микроорганизмов,  защиты интеллектуальной собственности на ценные штаммы.   
        Современное состояние науки и промышленности в Российской Федерации во многом определяет задачи, стоящие перед ВКПМ. Прежде всего, это сохранение национального фонда коллекционных штаммов, необходимого для перспективного развития биотехнологии; создание четко работающего механизма централизации, сохранения и обеспечения доступности штаммов, получаемых в отечественных лабораториях и поступающих в РФ из-за рубежа; создание современной нормативной базы работы с промышленно-ценными штаммами;  выполнение функций национального и международного органа по депонированию.  
   Формирование национального коллекционного фонда  и проводимая при этом стандартизация  промышленных  штаммов важны не только для обеспечения потребностей  исследовательских и промышленных  организаций в  коллекционных штаммах, но и  для обеспечения  биобезопасности  использования   штаммов в промышленности и  для обеспечения  защиты прав интеллектуальной собственности на промышленные микроорганизмы. 
Важной проблемой, решаемой в ходе формирования национального коллекционного фонда, является проблема  контроля за распространением промышленных микроорганизмов, в т.ч. ГИММ. 
          1  Функционирование Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов 
1.1 Выполнение комплекса  работ по поддержанию и расширению коллекционного       фонда 
Расширение коллекций проводится  путем осуществления различных форм депонирования ценных штаммов, за счет обмена коллекционными культурами с международными коллекциями. За отчетный период из международных коллекций получено более 20 культур.   Основными формами депонирования в ВКПМ являются  депонирование по форме “хранение”, национальное и международное патентное депонирование, депонирование по форме “гарантийное хранение”. Каждая форма депонирования предусматривает различные правила проверки свойств штаммов, распространения информации о штаммах и выдачи коллекционных культур.
Параллельно с  микробиологическими и  генетическими работами в ВКПМ выполняется большой объем работ по обработке информации о коллекционных штаммах.  На каждый коллекционный штамм оформляются стандартные паспорта, содержащие сведения о происхождении штамма, его  генетических особенностях, о промышленно-ценных качествах, свойствах, влияющих  на оценку уровня риска при работе со штаммом и т.д..  Часть паспортных сведений вносится в закрытую и открытую информационно-поисковые базы данных, а также в компьютерный каталог коллекционных  культур.
Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов представляет ряд коллекций, среди которых: 
а) коллекция промышленно-ценных бактериальных штаммов и коллекция бацилл
Коллекция промышленно-ценных штаммов  и бациллярная коллекция содержат  4411 штаммов. Эти штаммы предназначены для получения нескольких сот различных промышленно-ценных продуктов и для использования во многих технологических процессах.
 За отчетный период были получены продуценты комплекса биологически активных веществ, типовые штаммы, закваски для получения кисломолочных продуктов, продуценты аминокислот, ферментов: Bacillus subtilis; Bacillus benzoevorans; Bacillus licheniformis;  Bacillus pumilus; Lactobacillus acidophilus; Lactobacillus paracasei;  Streptococcus salivarius; Clostridium acetobutilicum;  Bacillus amyloliguefaciens:  Lactococcus lactis; Lactobacillus casei; Leuconostoc mesenteroides; Streptococcus thermophilus;  Alcaligenes faecalis; Bacillus sphaericus;  Bacillus stearothermophilus; Lactobacillus brevis; .
Microbacterium lacticum;   Corynebacterium glutamicum.
  
  По запросам организаций выдано 107 штаммов, в том  числе  выдано 79 промышленно-ценных штаммов, 2  - по Будапештскому договору и 26 тест-культур. Это культуры, входящие в закваски кисломолочных продуктов , продуценты ферментов, антибиотиков, типовые штаммы,  и др. 
В коллекцию поступило 87  культур (компоненты заквасок молочнокислых продуктов , продуценты пробиотиков,  типовые штаммы ), из них 65 штаммов депонировано по форме «национальное патентное депонирование»,  1 – по форме «международное депонирование»; 6 штаммов - по форме «хранение», 15 штаммов – по форме «гарантийное хранение».
За отчетный период в ходе проведенных плановых проверок жизнеспособности и контролируемых свойств проверено  и перезаложено на длительное хранение 200 культур. 
  Проведена   работа по редактированию и обновлению “Базы данных” и “Каталога  коллекционных  культур”. 
б) коллекция генетически маркированных бактериальных штаммов и бактериальных плазмид.
В настоящее время в коллекции насчитывается 4620 генетически маркированных штаммов, в том числе более 1000 штаммов содержат плазмиды. Наиболее широко в коллекции представлены различные мутанты E.coli, а также штаммы бактерий родов Bacillus, Azotobacter, Methilobacillus, Pseudomonas, Streptococcus.
Представленные в коллекции штаммы широко используются в генетических и молекулярно-биологических исследованиях. Многие коллекционные штаммы необходимы для проведения современных фундаментальных и прикладных генно-инженерных работ, в том числе для проектов, проводимых в рамках ФЦП. 
В коллекцию входят также бактериальные промышленно-ценные штаммы, полученные генно-инженерными методами, преимущественно продуценты аминокислот и  ферментов.
Плазмидная коллекция содержит более 1000 различных плазмид, находящихся в штаммах-хозяевах, а также в виде ДНК.  
Коллекция генетически маркированных штаммов и плазмид является самой крупной коллекцией из подобных коллекций в России и одной из крупнейших в мире.
За отчетный период проверена жизнеспособность и контролируемые генетические маркеры 68 штаммов. 25 культур после проверки размножено и повторно заложено на длительное хранение в лиофилизированном виде.
В коллекцию поступило 45  культур, некоторые из них несут плазмиды, сконструированные в отечественных и зарубежных лабораториях и эффективно использующиеся в современных молекулярно-генетических исследованиях,  15 штаммов депонировано по форме «национальное патентное депонирование», 30 – по форме «хранение».
Информация о поступивших штаммах внесена в информационную базу данных.
   По запросам  организаций из коллекции выдано 325 штаммов, из них 292 – тест-культуры, 33 – генетически маркированных штаммов.
  
          в) коллекция грибов
Всего в коллекции насчитывается 984 культуры. Культуры грибов являются продуцентами ферментов, органических кислот , каротиноидов), полиненасыщенных жирных кислот, тест-культурами для проверки грибостойкости различных материалов, антагонистами, применяющимися для биоконтроля фитопатогенных грибов, продуцентами комплекса фитогормонов, использующимися для разработки биоудобрений. В грибной коллекции есть продуценты биологически активных веществ – иммуномодуляторов; продуценты лимонной и глюконовой кислот; продуценты целлюлазы и гемицеллюлазы и др. 
       За отчетный период в грибную коллекцию поступили 5 культур, в том числе  Culvularia lunata; Laetiporus sulphureus; Ganoderma applanatum.
       Проводилась плановая проверка жизнеспособности культур, хранящихся в лиофильно-высушенном виде и под минеральным маслом (есть культуры, которые  погибают при лиофилизации) . Проверена жизнеспособность 90 лиофильно-высушенных культур и хранящихся под минеральным маслом на 3-4 различных средах: - из ампул (лиофильно- высушенных)  - 55 штаммов;  хранящихся под вазелиновым маслом – 34 штаммов;  из кельвинатора (-70оС, 10 % глицерин) – 4 штаммов (Blakeslea trispora).
В коллекцию поступила 5  культура, из них 4 штамма депонировано по форме «национальное патентное депонирование», 1 штаммов - по форме «хранение».
Проводилась  работа по редактированию и обновлению “Базы данных” и  
 “Каталога  коллекционных  культур”. 
За отчетный период по запросам различных организаций выдано 18 культур, в том числе 7 тест-культур, 11 штаммов -  для прикладных и исследовательских целей.
г) коллекция штаммов-продуцентов ферментов нуклеинового обмена и коллекция тест - культур чувствительности к различным антибиотикам.
Коллекция ферментов продуцентов нуклеинового обмена и тест-культур насчитывает 550 культур. Коллекция включает в себя эндонуклеазы рестрикции, ферменты нуклеинового обмена; тест-культуры на антибиотики, аминокислоты, витамины, дезинфицирующие средства и т.д.: 11 штаммов сине-зеленых водорослей, 2 культуры зеленых водорослей.      
За отчетный период в ходе проведенных плановых проверок жизнеспособности и контролируемых свойств проверено 117 и перезаложено на длительное хранение 98 культур, в том числе 40 тест-культур.
По запросам организаций выдано 409 культур, из них 400 – тест-культур, 9 – для прикладных целей.
В коллекцию поступило 7 культур:  Gluconobacter oxydans; Carboxydothermus sp.; Xanthomonas sp.;  Erwinia amylovora;     Acinetobacter calcoaceticus;  Alcaligenes faecalis.
4 культуры депонированы по форме  «хранение» и 3 - «гарантийное хранение».
Проводилась  работа по редактированию и обновлению “Базы данных” и  
   “Каталога  коллекционных  культур”. 
д) коллекция дрожжей
Коллекция дрожжей насчитывает 3338 штамма. Среди коллекционных штаммов продуценты нескольких десятков различных промышленно-ценных продуктов и штаммы, применяющиеся в  различных биотехнологических процессах, используемых в медицинской и пищевой промышленности, сельском хозяйстве и других областях. 
Дрожжевая коллекция ВКПМ близка по размеру и составу крупным национальным коллекциям США (АТСС), Германии (DSM), Англии (NCYC), Японии (IFO). В дрожжевой коллекции ВКПМ представлено много уникальных штаммов, предназначенных для использования в различных областях биотехнологии.  Коллекция  дрожжей представляет как научный, так и практический интерес для  поиска продуцентов новых промышленно-ценных веществ. 
  За отчетный период в коллекцию поступили следующие культуры:  Saccharomyces cerevisiae  с полностью секвенированным геномом; природные штаммы    
Bulleromyces albus;  Rhodotorula fujisanensis; Cryptococcus magnus;  Cryptococcus sp.;
 Dioszegia sp.; Rhodotorula glutinis;  Sporobolomyces sp.; продуценты ферментов, этанола.РНК: Yarrowia lipolytica;  Yarrowia lipolytica; Yarrowia lipolytica;  Saccharomyces cerevisiae .
Проведена плановая проверка жизнеспособности и контролируемых коллекционных свойств и повторная закладка на длительное хранение 112 штаммов дрожжей.
Из коллекции выдано 37 штаммов дрожжей, из них 17 тест-культур и 20 - для производственных и научных целей.
За отчетный период в коллекцию поступило 14  культуры, из них  9 штаммов депонировано по форме «хранение», 1 – по форме  «национальное патентное депонирование»; 4 штаммов – по форме «гарантийное хранение».
Полученные культуры внесены в электронную «Базу данных».
е) коллекция актиномицетов
Коллекция актиномицетов включает 1772 культур. Культуры, входящие в состав коллекции, находят широкое применение в практической деятельности человека как продуценты  антибиотиков медицинского и ветеринарного назначения, ферментов, полисахаридов, липидов, нуклеотидов, пигментов, кислот. Представители рода Bifidobacterium используются в качестве  заквасок различных кисломолочных продуктов, продуцентов молочной и уксусной кислот и др. Коллекция включает более 200 типовых штаммов, а также ряд тест-культур для определения активности антибиотиков и др. биологически активных веществ. 
За отчетный период в коллекцию поступили типовые штаммы,  продуценты антибиотиков и др.:  Micromonospora sp.;  Rhodococcus rubropertinctus;  Streptomyces miniscleroticus;  Gordonia rubropertincta;  Gordonia rubropertincta;  Rhodococcus erythropolis; Streptomyces lydicus.
Все культуры заложены  на хранение и внесены в базу данных. 
Всего получено 9 культур актиномицетов, 6 депонировано по форме «хранение», 3 - по форме  «национальное патентное депонирование».
   Проведена плановая проверка жизнеспособности, чистоты и контролируемых свойств 64 культур, заложенных на хранение в лиофилизированном виде. Все культуры повторно заложены на хранение.
По запросам различных организаций выдано 21 культура для прикладных и исследовательских целей.

ж) коллекция бактериофагов
Фаговая коллекция насчитывает 1091 генетически модифицированных модельных бактериофагов, предназначенных для использования в исследовательских целях, а также набор трансдуцирующих бактериофагов (более 500 штаммов), содержащих фрагменты ДНК, перекрывающие полностью хромосому наиболее хорошо генетически изученного объекта молекулярно-генетических исследований - бактерии E.coli). Помимо этих фагов поддерживается коллекция фагов, специфических более чем для 20 видов промышленно-ценных микроорганизмов (многие из них выделены в процессе фаголиза на производствах). Создана коллекция фагов, специфических  практически ко всем рецепторам E.coli, а также коллекция  бактериальных лизогенов E.coli по различным умеренным фагам. Эти коллекции эффективно используются, в частности, в ходе работ по созданию фагоустойчивых продуцентов на основе E.coli.
В коллекции продолжается работа по распространению нитчатых фагов, используемых в качестве тест - штаммов для санитарно - микробиологического анализа питьевой воды на водопроводных станциях России. 
За отчетный период проведена проверка жизнеспособности и контролируемых свойств 45 бактериофагов, с последующей лиофилизацией и перезакладкой 27 фагов. 
За отчетный период в коллекцию поступил 1 бактериофаг, депонированный по форме «хранение».
Из коллекции выдано 200 тест-культур бактериофагов.
Коллекция гибридом содержит 105 гибридом. 
1.2 	Выполнение функций национального и международного органа по депонированию    микроорганизмов.
В течение отчетного периода  ВКПМ строго выполняла все правила, установленные для работы ВКПМ в качестве национального и международного патентного депозитария микроорганизмов.
ВКПМ письменно и устно проводила консультации по различным вопросам, 
связанным с депонированием микроорганизмов, в том числе по правовым вопросам, касающимся процедуры депонирования и выдачи штаммов, возможности использования полученных штаммов, а также норм Будапештского договора.
Проводилась работа по выявлению информации о защищенности депонированных штаммов авторскими свидетельствами СССР, патентами России и др. стран. 
За отчетный период в  ВКПМ  принято 168 штаммов, в том числе 89 культур депонировано по форме «национальное патентное депонирование», 1- «международное патентное депонирование» . В соответствии с действующими правилами распространения коллекционных культур выдано 1117 штаммов, в том числе для реализации ФЦП выдано более 110 коллекционных культур микроорганизмов. Всего в коллекции поддерживается  16752 культуры.
Статистические данные приема/выдачи штаммов ВКПМ представлены в таблицах 1-3.
Таблица 1    Штаммы, выданные из ВКПМ, депонированные по форме “хранение” 

Использование 	Количество выданных штаммов	
Генетические исследования 	33	
Тест- культуры	 942	
 Использование в прикладных целях	  140	

Таблица 2                Штаммы, выданные из ВКПМ, депонированные по форме иной, чем “хранение” 

Форма депонирования	Количество выданных штаммов	Основание  для выдачи	
Национальное патентное	 -	Разрешение депозитора	
Международное патентное	 2	Нормы Будапештского договора	
Гарантийное хранение	-	-	

Таблица 3                      Штаммы, поступившие в ВКПМ 

Форма депонирования	Количество штаммов	
Хранение	                     57	
Национальное патентное депонирование	                     89	
Международное патентное депонирование	                      1	
Гарантийное хранение	                      21	

 
1.3 Выполнение сервисных исследований 

Выполнение разнообразных сервисных работ, связанных с использованием коллекционных микроорганизмов в исследовательских и практических целях, является важной стороной деятельности национальных сервисных коллекций. Эта функция вытекает из важной задачи, стоящей перед этими коллекциями - не только централизовать и сохранить ценные штаммы микроорганизмов, но и способствовать  их изучению  и эффективному использованию. Обладая возможностями осуществлять работу с широким кругом микроорганизмов и обрабатывать большие объемы информации о коллекционных штаммах, сервисные коллекции обычно помогают заинтересованным организациям в освоении методов работы с этими культурами, проверке их свойств, работе с информационными базами данных, дают разнообразные консультации по депонированию и патентной защите промышленно-ценных штаммов.
   За отчетный период в ВКПМ  для сторонних организаций проведено:
   - более 50 консультаций по работе с коллекционными штаммами, касающимися культивирования микроорганизмов,  различных форм депонирования микроорганизмов;
  -20 работ  по идентификации штаммов  микроорганизмов до вида  с помощью анализа 16S РНК для сторонних организаций;   
  -  11 работ по паспортизации штаммов путем ДНК фингерпринта  микроорганизмов с использованием метода ПЦР; 
 - научно-практические практикумы для студентов  Университета Пищевой биотехнологии, Университета Пищевых производств и Московского государственного университета, с последующим прохождением преддипломной практики и подготовкой дипломной работы.
Целью практикумов являлось получение навыков работы с различными микроорганизмами (бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы),  освоение методов по таксономической и штаммовой идентификации микроорганизмов на основе ПЦР,  методы выделения суммарной ДНК клетки, электрофореза, ПЦР, анализа первичных последовательностей ДНК с использованием компьютерных программ (Chromas, BLAST, рибосомальной базы данных, применение Vector NTI для этих целей), построение филогенетических деревьев, дополнительное использование других консервативных последовательностей при идентификации близкородственных микроорганизмов, использование ДНК фингерпринта на основе RAPD ПЦР для сравнения штаммов.
На базе ВКПМ проведена научно-исследовательская работа по теме «Разработка технологии воспроизводства лиофилизированных заквасок по зарубежным аналогам для производства сыра».
Получено  свыше 20 культур из международных коллекций.
   
      1.4  Оценка  эффективности функционирования ВКПМ
         
     Оценка  эффективности функционирования ВКПМ в качестве уникальной установки основывается на значении исследовательских и прикладных работ, в которых использовались штаммы, полученные из ВКПМ, и для выполнения которых требовалось   выполнение сервисных  работ на базе ВКПМ.
    В отчетный период объем штаммов,  выдаваемых из ВКПМ   для использования в исследовательских и прикладных целях,  составил 1117.   Выдаваемые штаммы  используются исследовательскими организациями в ходе выполнения  НИР по приоритетным направлениям научных исследований.  Десятки  штаммов взяты для  непосредственного  использования  на промышленных биотехнологических предприятиях,  включая  предприятия пищевой биотехнологии. Более половины выданных  штаммов используются для   исследований  по контролю экологии окружающей среды,  проверки качества продуктов,  в качестве стандартов при проведении микробиологических исследований.
    ВКПМ  активно  участвует в  различных исследовательских проектах как на этапах штаммовой и таксономической идентификации штаммов микроорганизмов, так и на этапе патентования штаммов и процессов их использования,   осуществляя национальное и патентное депонирование штаммов (в качестве национального и международного органа по депонированию). ВКПМ участвует в следующих контрактах, в том числе в ВИП-проекте: 
 « Производство рекомбинантных белков для медицинского применения на основе культур клеток животных и микроорганизмов с использованием высокоэффективных технологических платформ»; «Разработка продуцентов липазы для ферментных препаратов заместительной терапии»; «Реконструкция метаболизма бактерий с помощью сенсорных РНК и получение на этой основе штаммов-продуцентов»; «Разработка научных основ нанотехнологии для создания биосовместимых материалов медицинского назначения на базе рекомбинантных аналогов белков паутины». 
            ВКПМ участвует в международном проекте «Бактериальные антагонисты сине-зеленых водорослей» в рамках Межправительственного соглашения по научно-техническому сотрудничеству с КНР,  а также принимает участие в 13 грантах РФФИ.
  2  Разработка  правил  работ  с коллекционными  генно-инженерными  штаммами 
        (правил  депонирования ГИММ в ВКПМ)

         Настоящие правила определяют порядок определения уровня риска для ГИММ, депонируемых во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов  (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика.
   Настоящие правила разработаны  на основании   Федерального закона РФ « О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности»  с учетом международной практики и  правил работ  с генетически-модифицированными  штаммами  национального института здоровья США (NIH).
При разработке правил использовались следующие документы:
1.Федеральный закон РФ « О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности»
2. Санитарные правила СП 1.2.731-99   Приложение 5.1
3. Правила депонирования в коллекции ВКПМ  <genetika.ru>
NIH Guidelines  http://www4.od.nih.gov
4. U.S. Food and Drug Administration. Center for food safety and applied nutrition http://www.cfsan.fda.gov
5. Закон РФ « О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения»  
 Сокращения, термины, определения, используемые  при разработке правил:                                  
      1). Генно-инженерно-модифицированный микроорганизм (ГИММ) означает микроорганизм,   генетический материал которого был изменен не осуществляемым в природе способом.
2).Физическая защита – создание и использование специальных защитных средств, приемов и устройств, предотвращающих распространение биологических агентов в окружающем пространстве и обеспечивающих биобезопасность при  их использовании. 
3). Биологическая защита-  создание и использование в генетической  инженерии безопасных векторов и клеток- хозяев, биологические свойства которых исключают выживание их в окружающей среде и передачу генетической информации.
4) Векторы - генетические структуры, полученные из ДНК бактериофагов, плазмид, вирусов или иного источника, которые приносят в клетку чужеродную ДНК и обеспечивают репликацию и экспрессию последней в клетке – хозяине.
5). Генетическая инженерия- создание in vitro  биологически активных генетических структур и их введение в клетки микроорганизмов.
6).Клетка - хозяин – клетка, включающая искусственно внесенный генетический материал, состоящий из рекомбинантных ДНК.
7).Рекомбинантные  ДНК – молекулы нуклеиновой кислоты, полученные соединением  in vitro фрагментов ДНК, принадлежащих к разным биологическим видам, в естественных условиях не образующих таких гибридных молекул, которые способны реплицироваться в клетке- хозяине в составе хромосом или в виде автономных структур.
8). Система вектор-хозяин (ВХ) – это живой микроорганизм и введенная в него рекомбинантная молекула ДНК. Система должна рассматриваться как единое целое.
9). Mob. сайт-  ген, ответственный за перенос ДНК от одного микроорганизма  к другому.
10). Gras (generally recognized as safe) статус -  этот статут получают микроорганизмы и различные вещества, которые имеют длительную историю безопасного применения в пищевой промышленности США , подтвержденную экспериментальными данными.    
11).  Группы  риска -   это классификация  микроорганизмов по таксономическому признаку, принятая в правилах NIH , основывающаяся  на  таких  факторах, как  вирулентность, патогенность, инфекционная доза, стабильность в окружающей среде, аллергенность,  возможность лечения вакцинами  и.т. д.
12).  Уровень биобезопасности микроорганизма - это  показатель  степени  безопасности  штаммов микроорганизма, учитывающий  группу  риска  микроорганизма,  известные свойства конкретного штамма, определяющие  уровень физической  защиты при работе с данным штаммом и при его распространении.
 13).  Уровень физической защиты -   это комплекс  мер,  необходимых для обеспечения биобезопасности при  работе с ГИММ, предусматривающие уменьшение контакта ГИММ с работающим персоналом, населением  и окружающей средой.
14). Уровень биологической защиты ГИММ – это показатель  способности ГИММ распространяться в природе. Уровень биологической защиты определяют такие факторы, как   выживаемость  ГИММ в окружающей среде,  инфекционность, возможность генетического переноса клонированной ДНК и т.д.  Существуют два уровня в  зависимости от использования  системы вектор – хозяин:    1  (низкий уровень ) или  2 (высокий уровень ).
15).  Уровень биобезопасности ГИММ  -   это  показатель безопасности  ГИММ,  определяемый на основе  группы риска  ( уровня биобезопасности) штамма-хозяина,   уровня   биологической защиты ГИММ, определяющий меры физической защиты, необходимые для работы с ГИММ ( в соответствии с правилами  NIH)
16).  Уровень риска  при работе с ГИММ  (1ый- 4ый)  - это показатель   степени потенциальной опасности, возникающей при осуществлении генно-инженерной деятельности  в соответствии с законом РФ  о генно-инженерной деятельности (соответствует уровням биобезопасности ГИММ по правилам NIH). 
          Постановлением Совета Министров РФ N725-47 от 24.06.96 г   Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ) уполномочена обеспечивать формирование национального  коллекционного фонда промышленно-ценных микроорганизмов, включая генно-инженерно- модифицированные микроорганизмы 1 и 2 ой групп риска  (классификации  NIH Guidelines  http://www4.od.nih.gov).
      Данные правила  работ  с коллекционными  генно-инженерными  штаммами (далее  правила  депонирования ГИММ в ВКПМ)  имеют своей целью ограничить  потенциальную опасность, которую могут представлять ГИММ для здоровья людей и  окружающей среды.  Как и с любыми  микроорганизмами,  работа с ГИММ должна проводиться с учетом биологической безопасности. Общая потенциальная опасность микроорганизма  характеризуется факторами  патогенности и зоопатоненности, токсигенностью,  аллергенностью   и другими факторами,  негативно влияющими на здоровье человека и животных,  включая  мутагенность, канцирогенность,  нейротоксичность. 
        Так как потенциальная опасность ГИММ зависит от свойств  клетки- хозяина и привнесенной генетической конструкции, то уровень физической защиты при работе с любыми микроорганизмами должен быть не ниже, чем  при работе с исходным штаммом микроорганизма хозяина. 
  В соответствии с санитарными правилами СП 1.2.011-94     в  Российской Федерации  микроорганизмы (включая вирусы)  классифицируются по уровню их патогенности. 
ВКПМ принимает на депонирование непатогенные микроорганизмы, т.е. микроорганизмы тех видов,  которые не включены   в  списки, приведенные  в санитарных правилах СП 1.2.011-94 , за исключением   штаммов  некоторых  видов  микроорганизмов, отнесенных  к   3 или 4 группе патогенности , но являющихся безопасными для промышленного использования на основании  заключений  о их непатогенности,  выданные уполномоченными  организациями  РФ   или  штаммы, полученные из международных коллекций культур, отнесенные к 1-ой или 2-ой группе биобезопасности  по классификации NIH (Национального института здоровья США) (http://www4.od.nih.gov/Appendix G).
      В международных  коллекциях для безопасной работы со штаммами  всем микроорганизмам присваивается уровень биобезопасности с 1-го по 4-й  в зависимости от группы риска микроорганизма и  конкретных свойств каждого штамма. Уровень биобезопасности определяет  уровень физической защиты при работе с каждым штаммом. 
      Согласно правилам NIH , в соответствии с таксономической идентификацией все микроорганизмы  делятся на   4 группы риска. (http://www4.od.nih.gov/Appendix В).  К первой группе риска относятся микроорганизмы, которые не вызывают заболеваний у человека, ко второй группе риска  относятся микроорганизмы,   редко вызывающие заболевания у человека,   лечение которых не представляет  особых трудностей.
       Для безопасной работы с  микроорганизмами каждой из групп безопасности предусматриваются необходимые меры физической защиты с 1-го (минимальный) по 4-ый (максимальный)  (http://www4.od.nih.gov/Appendix G).  В ВКПМ  для работы с непатогенными микроорганизмами используются   1-й и   2-й уровень физической защиты. 
    1-й уровень (минимальный).
    Эксперименты, требующие физической защиты 1-го уровня, могут проводиться в помещении, предназначенном  для работы с непатогенными микроорганизмами с помощью общепринятых микробиологических методов.  Работа может  проводиться на открытых поверхностях, без специального защитного оборудования, не требуется специальных инженерных устройств. В помещении должна поддерживаться строгая чистота. Приемы и хранение пищи, курение в этом помещении запрещены. В работе следует использовать  только механические пипетки.
    2- уровень (низкий)
    Эксперименты, в которых необходима физическая защита 2-го уровня, могут проводиться в тех же помещениях, что предназначены для работы с 1-м уровнем защиты, но доступ посторонних лиц  ограничивается.  В здании, где расположена  лаборатория, должен быть автоклав. Режим и условия работы приборов, создающих опасность образования  аэрозоля (водоструйные и прочие насосы, лиофилизаторы,  ультразвуковые  дезинтеграторы, качалки и  прочее оборудование) размещаются таким образом, чтобы свести к минимуму поступление частиц аэрозоля в воздух помещения,  используются боксы и ламинарный поток воздуха. Использованные в опыте материалы, содержащие микроорганизмы, обеззараживаются. 
    В международных коллекциях,  в  том числе и американской коллекции АТСС,  существуют 4 уровня биобезопасности  штаммов, определяющих правила обращения с данными микроорганизмом во время работы  или при пересылке их по почте. 
 ВКПМ принимает  на депонирование штаммы из международных коллекций, относящиеся к 1-ому  уровню  биобезопасности (микроорганизмы,  не требующие специальных мер предосторожностей при работе с ними и не представляющие опасности  для здоровья человека) и 2-ому   уровню биобезопасности 
( микроорганизмы,  не требующие специальных мер предосторожностей при работе с ними и которые могут представлять незначительный вред для  здоровья человека).
     В отношении ГИММ    согласно закону РФ « О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности»   в зависимости от степени потенциальной опасности устанавливается четыре уровня риска потенциального воздействия генно-инженерной деятельности на здоровье человека с учетом биологической и физической защиты для замкнутых систем, соответствующие 4-м уровням биобезопасности по правилам NIH (http://www4.od.nih.gov/Appendix G). 
    Все меры  безопасности, снижающие инфекционные свойства ГИММ, уменьшающие их выживаемость в окружающей среде и  устраняющие возможность  генетического переноса,  составляют биологическую защиту. Предусмотрены  два уровня биологической защиты (ВХ-1 и ВХ-2) .  Меры биологической защиты зависят как от свойств микроорганизмов, используемых в качестве хозяина, так и от свойств внесенной генно-инженерной конструкции. При этом должна учитываться как прямая опасность ГИММ, связанная с его способностью вызывать болезни человека, животных, так и косвенная опасность, связанная со способностью ГИММ выживать в окружающей среде и передавать вновь приобретенную генетическую  информацию  в другие организмы. Предусматривается два уровня биологической безопасности  при работе с ГИММ, при этом клетка- хозяин и вектор используются как единая система вектор- хозяин (ВХ). Уровень ВХ-1 - это умеренная безопасность, связанная с незначительным биологическим  загрязнением,  уровень ВХ-2 - высокая безопасность, связанная в высоким уровнем биологического загрязнения.   
       Существуют сертифицированные системы ВХ- 1 и ВХ-2, которые описаны в правилах  национального института здоровья США (NIH) (http://www4.od.nih.gov/, Appendix E). Новые системы ВХ-1 и ВХ-2 должны быть сертифицированы. 
   На основе анализа свойств  клетки - хозяина и  внесенной генетической конструкции, каждому  ГИММ  присваивается  определенный  уровень риска.   ВКПМ как коллекция непатогенных микроорганизмов имеет право работать с ГИММ, которые могут быть отнесены к  I   уровню или ко II  уровню риска (или 1-2 уровню безопасности согласно правилам NIH).
     I уровень риска соответствует работам, которые не представляют опасности для здоровья человека и сопоставим с риском при работе  с непатогенными микроорганизмами.
    II уровень риска соответствует работам, которые представляют незначительную  опасность для здоровья человека и сопоставимы с опасностью при работе с условно- патогенными микроорганизмами.
      Основой для оценки риска является  информация,   приводимая депозитором  в паспорте  штамма ГИММ,  депонируемого в ВКПМ  (форма ВР-1 прил.1.6  паспорт для генетически-модифицированных штаммов ГИММ, приведенный в Правилах  депонирования штаммов в коллекции ВКПМ  <www. genetika.ru>).   В паспорте приводится  заключение комиссии по генно-инженерной деятельности об отнесении штамма к определенной группе риска  (группе биобезопасности по классификации  NIH) c  обязательным обоснованием сделанного заключения на основе критериев, приведенных в  Правилах NIH  (http://www4.od.nih.gov ).  ВКПМ принимает на депонирование штаммы ГИММ,  отнесенные комиссией по генно-инженерной деятельности  к 1 или 2 уровню риска (или 1-2 уровню безопасности согласно правилам NIH) и вправе потребовать  от депозитора  все необходимые сведения  для  уточнения  и проверки    заключения, если в этом возникнет необходимость. 
   Если  депозитор не может предоставить такого заключения, то комиссия  по генно-инженерной деятельности ФГУП ГосНИИгенетики  по представлению  материалов от ВКПМ может рекомендовать  группу риска на основании изучения предложенных материалов от депозитора, но всю полную ответственность за правильность заключения несет депозитор. 
      Подготовка материалов  для  комиссии по генно-инженерной деятельности    начинается с  того, что   делается  заключение:  подпадает ли   данный  ГИММ под  исключения  из  правил, которые регулируют   работу с ГИММ в  NIH.  На основании  накопленных знаний и длительного и безопасного опыта работы  с некоторыми  ГИММ,  ряд генно-инженерных конструкций  исключается из регуляции правилами NIH. ( http://www4.od.nih.gov/, Appendix C).  Если депонируемый ГИММ попадает под действие исключений, ему рекомендуется первый уровень биобезопасности  как при работе с микроорганизмами 1-й группы риска согласно правилам NIH (http://www4.od.nih.gov/Appendix С), работа с которым не  требует специальных мер предосторожностей. Если генетическая конструкция не подпадает под действие исключений, то  следует  внимательно изучить факторы,  определяющие безопасность ГИММ, при этом  учитываются свойства  единой системы  вектор-хозяин и вносимой генетической конструкции.   Институтская комиссия   может  дать заключение о безопасности ГИММ, только если для  конструкции ГИММ использовалась сертифицированная  система  хозяин- вектор в соответствии с правилами  NIH (http://www4.od.nih.gov/Appendix Е), при этом  главное внимание уделяется клонируемому фрагменту ДНК.  Безопасность ДНК  клонируемой ДНК возрастает,   если она имеет минимальные размеры, не содержит рамок считывания с неизвестными функциями, не содержит элементов транспозиции,  не содержит генов, определяющих  токсичность или вирулентность, не увеличивает выживаемость в окружающей среде, нет генов, влияющих на иммунную систему,  нет генов, определяющих синтез аллергенов  и  суперпродукцию ферментов, способных негативно влиять на здоровье человека и окружающую среду,  если все вышеперечисленные свойства можно подтвердить анализом полной нуклеотидной последовательности.
      Если штамм  ГИММ, не подпадающий под действие исключений, создан на основании  не сертифицированной системы  хозяин- вектор, то решение об определении уровня риска  дает межведомственная комиссия  министерства здравоохранения РФ. Возможны  случаи исключений, когда отсутствует сертификация  в использованной системе хозяин-вектор, но известен длительный опыт безопасного использования  штамма-хозяина,  получения им  GRAS  - статуса в соответствии с данными американского центра безопасности питания  (U.S Center for  food  safety and applied nutrition www.cfsan.fda.gov); когда клонированный  фрагмент ДНК из непатогенных микроорганизмов интегрирован в хромосому и отвечает всем перечисленным выше требованиям для  рекомбинантных  ДНК, вектор нетрансмиссивен и не имеет  mob. сайтов, отсутствуют гены устойчивости к антибиотикам, использующимся в медицинских целях. Решение  о присвоении уровня риска   данному штамму ГИММ имеет только институтская комиссия  по генно-инженерной деятельности ФГУПГосНИИгенетики,  которая в течение двух недель обязана  сообщить свое решение  об  уровне риска штамма ГИММ.
     Риск  работы по получению, хранению, пересылке и использованию ГИММ должен быть адекватно оценен и должны быть использованы соответствующие меры физической и биологической защиты.
       ВКПМ  контролирует правильность заключения  об уровне риска ГИММ на основании предоставляемых сведений. В случае необходимости ВКПМ  может  потребовать от депозитора дополнительных сведений для оценки  уровня риска и высказать обоснованные возражения по результатам оценки уровня риска.
       Граждане РФ   или нерезиденты,  работающие на территории РФ,   предоставившие недостоверную информацию,  на основании которой делается заключение об уровне риска ГИММ и тем самым  допустившие санитарные правонарушения, могут быть привлечены к дисциплинарной, административной и уголовной ответственности   согласно  статье 27 Закона РФ « О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения»  и статье 12 Закона  « О государственном регулировании  в области генно - инженерной деятельности».

                             Заключение
      За отчетный период   выполнены все работы , предусмотренные   планом  проекта «Формирование, сохранение и изучение национального фонда микробных генетических ресурсов на базе УСУ "Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов" (ВКПМ), обеспечивающего проведение исследований по приоритетному направлению "Живые системы». В целях контроля за состоянием коллекции  проведена плановая проверка  жизнеспособности и контролируемых  свойств 696 коллекционных штаммов.  В коллекцию принят 168 штаммов микроорганизмов, в том числе, 89 штаммов принято на национальное патентное депонирование и 1 – на международное патентное депонирование. Полученные культуры представляют интерес для использования в прикладных  и исследовательских целях. Все поступившие  в коллекцию штаммы прошли необходимую проверку и заложены на длительное хранение с использованием   современных технологий лиофилизации и криоконсервации. 
    Бесперебойное функционирование ВКПМ в качестве национальной сервисной коллекции, выполняющей функции национального и международного органа по депонированию,  позволяет обеспечивать сохранность и доступность национального фонда коллекционных промышленно-ценных и генетически-маркированных  штаммов, обеспечивать  возможность  национальной и международной защиты прав интеллектуальной собственности на промышленно-ценные штаммы микроорганизмов. По поводу предоставления штаммов и выполнения различных сервисных исследований в коллекцию обратилось  более 150 организаций. По заявкам потребителей из коллекции выдано 1117 штаммов микроорганизмов, для реализации ФЦП выдано более 110 коллекционных культур.          Продолжено оснащение ВКПМ современным оборудованием и приборами.
                   На основании   Федерального закона РФ « О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности»  с учетом международной практики и  правил работ  с генетически-модифицированными  штаммами  национального института здоровья США (NIH) разработаны правила депонирования ГИММ в ВКПМ.

Этап4

ВЫПОЛНЕНИЕ ФУНКЦИЙ НАЦИОНАЛЬНОГО ЦЕНТРА МИКРОБНЫХ БИОРЕСУРСОВ. ОБЕСПЕЧЕНИЕ СОХРАННОСТИ И РАСШИРЕНИЯ КОЛЛЕКЦИОННОГО ФОНДА ВКПМ. РАЗВИТИЕ ИНФОРМАЦИОННО-ПОИСКОВОЙ БАЗЫ ДАННЫХ О КОЛЛЕКЦИОННЫХ ШТАММАХ.
Реферат
           
           МИКРООРГАНИЗМЫ, ШТАММЫ, ПАТЕНТНЫЙ ДЕПОЗИТАРИЙ, ДЕПОНИРОВАНИЕ, ХРАНЕНИЕ, ЛИОФИЛИЗАЦИЯ, КРИОКОНСЕРВАЦИЯ, БАКТЕРИИ, БАЦИЛЛЫ, ГРИБЫ, АКТИНОМИЦЕТЫ, ДРОЖЖИ, ФАГИ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ, БИОБЕЗОПАСНОСТЬ
Цель работы: Проведение исследований и обеспечение научно-исследовательских, опытно-конструкторских и технологических работ, проводимых организациями Российской Федерации, с предоставлением возможности использования специальных методик; Развитие материально-технической базы УСУ «Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов» (ВКПМ) путем дооснащения приобретаемым научным оборудованием для обеспечения и развития исследований в режиме коллективного пользования.
 В ходе выполнения проекта в полном объеме выполнены запланированные работы по контролю за состоянием коллекционного фонда, обеспечению ее сохранности и развития.   Проведены плановые выборочные проверки жизнеспособности и контролируемых паспортных свойств  более 2400 коллекционных культур,  подготовлены необходимые  повторные закладки на длительное хранение, в т.ч. с использованием лиофилизации и криоконсервации,  обеспечены необходимые режимы хранения коллекционного фонда.  Коллекция пополнилась 707 новыми штаммами,  применяемыми в промышленности и в научных исследованиях. 
     Бесперебойное функционирование ВКПМ позволило обеспечивать сохранность и доступность национального фонда коллекционных промышленно-ценных и генетических штаммов, выполнение всех функций национального центра микробных биоресурсов. Обеспечены заявки организаций на коллекционные штаммы и сервисные работы, необходимые, в частности, для реализации ФЦП; осуществлено депонирование микроорганизмов по формам  «хранение»,  « национальное» и «международное»  патентное депонирование. На национальное патентное депонирование принято 306 штаммов, на международное депонирование принято 3 штамма.  Вся информация о депонируемых штаммах стандартизирована и введена в информационно-поисковую базу данных.  По заявкам потребителей из коллекции выдано 3500 штаммов, для реализации ФЦП выдано более 300 коллекционных культур. Подготовлена  новая редакция правил  ВКПМ в области обеспечения биобезопасности   работ  с генетически-модифицированными  штаммами,   разработаны правила депонирования ГИММ в ВКПМ. 
                    
 Подготовлены методики  для проведения работ по поддержанию коллекционного фонда, штаммовой и таксономической идентификации культур
      В соответствии с пунктом 4.3. технического задания произведено оснащение уникальной установки ВКПМ научным оборудованием.

Обозначения и сокращения
      В настоящем отчете о НИР применяются следующие обозначения и сокращения

ВКПМ - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика
ЦМБР – центр микробных биоресурсов
ГИММ - генно-инженерно-модифицированные  микроорганизмы 
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота  
РНК – рибонуклеиновая кислота

Содержание
                                                                                                                                           Стр.
   Введение   ……………………………………………………………………………..7                                                                                                                                    
   1 Функционирование Всероссийской коллекции промышленных  микро-
      организмов…………………………………………………………………………...10   
1.1.	.Подготовка методик для проведения работ по поддержанию коллекцион-
       ного             фонда, штаммовой и таксономической идентификации культур.10
                                     
                1.2. Выполнение комплекса  работ по поддержанию и расширению  
                       коллекционного       фонда ……….……………………………………………..15
              1.3. Выполнение функций национального и международного органа 
    по        депонированию    микроорганизмов…………………………………….20
               2.   Редакция правил  ВКПМ в области обеспечения биобезопасности. …………22
                3.  Обоснование выбора оборудования…………………………………………….30
                   Заключение       ………………………………………………………..………. ….34              

Введение
     Основанием для проведения НИР, выполняемой в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы»   является Государственный контракт от 19 апреля 2007 г. № 02.518.11.7053.
   Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) является национальной сервисной коллекцией РФ, на которую, в соответствии с постановлением Совета Министров РФ N725-47 от 24.06.96 г., возложена ответственность за централизацию, обеспечение сохранности и доступности ценных штаммов микроорганизмов, предназначенных для использования в исследовательских и прикладных целях. В 2009 году исполнится 40 лет c момента образования ВКПМ. 
Коллекционные фонды ВКПМ, насчитывающие в настоящее время 16887 штаммов, формируются    за счет наиболее ценных штаммов, создававшихся в отечественных лабораториях и поступавших из-за рубежа. Основу коллекционного фонда составляют штаммы микроорганизмов, созданные в отечественных лабораториях,  депонированные  в ВКПМ в связи с использованием их в процессах, защищенных авторскими свидетельствами или патентами, а также промышленно- ценных штаммов микроорганизмов,  использовавшихся на заводах микробиологической промышленности   (эти штаммы передавались в ВКПМ в период 1969-1992 г.г., в соответствии с существовавшими ведомственными нормативными документами). 
      В настоящее время в ВКПМ, фактически, стала выполнять функции национального центра микробных биоресурсов биотехнологического назначения. Подобные Центры создаются в последние годы в   большинстве промышленно развитых стран  на базе ведущих национальных  сервисных коллекций микроорганизмов (Biological resources centers – BRC).     Центры микробных биоресурсов  стали основным инфраструктурным  элементом, необходимым для  развития  промышленной биотехнологии.     Интенсивное развитие биотехнологии  основано на  все более широком использовании разнообразных штаммов микроорганизмов в научных и прикладных целях.  Современная методология генной инженерии,   быстрое расширение количества секвенированных генов и целых геномов микроорганизмов, растений и животных открывает широкие возможности  к поиску генов, контролирующих самые разнообразные биологические функции, созданию нового поколения эффективных   микробных продуцентов  со значительно более широким спектром синтезируемых промышленно-ценных продуктов    и уникальными практически ценными свойствами. Исследователям, работающим в области биотехнологии, требуется оперативный доступ к  информации о доступных микроорганизмах, сами микроорганизмы, генетические конструкции и  отдельные клонированные гены.  Становятся более актуальными  проблемы, связанные со скринингом природных штаммов, обладающих новыми ценными свойствами, сохранению крупных коллекций подобных штаммов и новых штаммов, созданных в результате научных исследований, обеспечению их доступности для  научной общественности. В ходе реализации проекта ВКПМ  в 2008 г.  для использования в исследовательских и прикладных целях выдала более 800 штаммов.   Выдаваемые штаммы, в основном,  используются исследовательскими организациями в ходе выполнения  НИР по приоритетным направлениям научных исследований.  Десятки  штаммов взяты для  непосредственного  использования  на промышленных биотехнологических предприятиях,  включая  предприятия пищевой биотехнологии. Около 3000 выданных  штаммов используются для   исследований  по контролю экологии окружающей среды,  проверки качества продуктов,  в качестве стандартов при проведении микробиологических исследований.
    В ходе выполнения проекта ВКПМ  обеспечивала, в частности, необходимыми штаммами  все исследовательские проекты института, проводимые в рамках программы инновационных исследований РФ:   ВИП-проект -  « Производство рекомбинантных белков для медицинского применения на основе культур клеток животных и микроорганизмов с использованием высокоэффективных технологических платформ»;  «Реконструкция метаболизма бактерий с помощью сенсорных РНК и получение на этой основе штаммов-продуцентов»; «Разработка научных основ нанотехнологии для создания биосовместимых материалов медицинского назначения на базе рекомбинантных аналогов белков паутины».
        ВКПМ осуществляла большой объем сервисных работ по заказу более 100 биотехнологических организаций, связанных со штаммовой и таксономической идентификацией штаммов микроорганизмов, с использованием молекулярно-генетических методов. Полностью обеспечены потребности отечественных организаций в осуществлении национального и международного патентного депонирования (выполнение функций национального и международного органа по депонированию).  На национальное патентное депонирование принято свыше 300 штаммов, на международное депонирование принято 3 штамма.  

      Бесперебойное функционирование ВКПМ позволило обеспечивать сохранность и доступность национального фонда коллекционных промышленно-ценных и генетических штаммов, выполнение всех функций национального центра микробных биоресурсов. 
      В рамках проекта ВКПМ обеспечивала также  характеристику свойств и стандартизацию промышленно-ценных штаммов, в т.ч. генно-инженерно-модифицированных, в целях обеспечения биобезопасности при их использовании. 
     Важная   роль в решении вопросов биобезопасности,  связанных с использованием микроорганизмов, принадлежит  ВКПМ, в которой депонируется большинство промышленных штаммов микроорганизмов.    ВКПМ   не только поддерживает стандартные образцы штаммов, предлагаемых для использования в промышленности, но и объективно оценивает достоверность всех сведений о штаммах, необходимых для оценки их биобезопасности. На основе этих сведений, в соответствии с разработанными  международными критериями,  ВКПМ определяет уровни биобезопасности коллекционных штаммов, что в свою очередь  позволяет  определить необходимые меры физической защиты, гарантирующие биобезопасность при использовании этих штаммов.
     В ходе выполнения проекта в ВКПМ разработаны  правила  работы  с коллекционными  генно-инженерными  штаммами   (правила  депонирования ГИММ в ВКПМ).  Эти          правила определяют порядок определения уровня риска для ГИММ, депонируемых во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов.
     В ВКПМ формируется информационная база данных о всех коллекционных штаммах, включающая информацию об уровнях их биобезопасности и  сведения об опыте их практического использования (включая возможные негативные последствия этого использования).     ВКПМ постоянно занимается анализом нормативной базы, используемой для обеспечения биобезопасности и подготовкой предложений по совершенствованию этой нормативной базы.
        Современное состояние науки и промышленности в Российской Федерации во многом определяет задачи, стоящие перед ВКПМ. Прежде всего, это сохранение национального фонда коллекционных штаммов, необходимого для перспективного развития биотехнологии; создание четко работающего механизма централизации, сохранения и обеспечения доступности штаммов, получаемых в отечественных лабораториях и поступающих в РФ из-за рубежа; создание современной нормативной базы работы с промышленно-ценными штаммами;  выполнение функций национального и международного органа по депонированию.  
   Формирование национального коллекционного фонда  и проводимая при этом стандартизация  промышленных  штаммов важны не только для обеспечения потребностей  исследовательских и промышленных  организаций в  коллекционных штаммах, но и  для обеспечения  биобезопасности  использования   штаммов в промышленности и  для обеспечения  защиты прав интеллектуальной собственности на промышленные микроорганизмы. 
Важной проблемой, решаемой в ходе формирования национального коллекционного фонда, является проблема  контроля за распространением промышленных микроорганизмов, в т.ч. ГИММ. 
          1.  Функционирование Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов 
1.1 Подготовка методик для проведения работ по поддержанию коллекционного фонда, штаммовой и таксономической идентификации культур

Поддержание коллекционных фондов ВКПМ обеспечивается выполнением комплекса научных и технологических работ по сохранению и расширению коллекционного фонда ВКПМ, включающего плановые выборочные проверки жизнеспособности коллекционных штаммов, осуществление, в случае необходимости,  повторных закладок на длительное хранение, в т.ч. с использованием лиофилизации и криоконсервации, проведение проверок контролируемых паспортных свойств коллекционных культур и обеспечение необходимых режимов хранения. Сохранность штаммов, хранящихся в коллекции во многом зависит от правильного выбора режима хранения микроорганизмов. В ВКПМ постоянно проводятся исследования по подготовке методик для проведения работ по поддержанию коллекционного фонда. Характеристика используемых методов сохранения и консервации культур приводится ниже.
            А). Метод периодических пересевов
Старый традиционный метод, широко используемый в лабораторной и производственной практике. Метод основан на периодическом 0,5-10 месяцев пересеве хранящихся культур со старых питательных сред на свежие.
Достоинства: Простота, отсутствие специального оборудования.
Недостатки: Трудоемкость, риск заражения культур, возможность нежелательной селекции генетических вариантов или мутантов, приводящей к потере ценных признаков. 
Б) Хранение под минеральным маслом
      Один из наиболее старых способов хранения микроорганизмов. Метод наиболее пригоден для мицелиальных грибов, многие из которых не выдерживают высушивания и замораживания.
Достоинства: Простота в исполнении, не требуется какого-либо специального оборудования.
Недостатки: Биохимические процессы в микроорганизмах, хранящихся под минеральным маслом не прекращаются, а только замедляются. Это может привести к проявлению нежелательных изменений, связанных, например, с продуктивностью штамма. При хранении таким способом с высокой долей вероятности в популяции клеток могут накапливаться менее активные варианты.
В) Высушивание
      Процесс высушивания происходит, как правило, в присутствии обезвоживающего агента (силикагеля, хлористого кальция) под вакуумом без перевода клеток микроорганизмов в жидкое состояние в виде суспензий. Обезвоживание и дальнейшее хранение часто проводят на специальных наполнителях, которые играют роль сорбентов и выполняют защитные функции одновременно. Такими наполнителями могут быть, например, кварцевый песок, фильтровальная бумага, обезвоженный силикагель, фарфоровые шарики и т.д. Метод позволяет сохранять микроорганизмы в жизнеспособном состоянии от нескольких месяцев до нескольких лет.
Достоинства: Простота, отсутствие дорогостоящего оборудования.
Недостатки: Зависимость  от условий предварительного культивирования, длительность самого процесса.
        Г) L-высушивание
   Процесс высушивания суспензии микроорганизмов в защитной среде под вакуумом.
Достоинства: Относительная простота метода, хорошая сохранность микроорганизмов и их положительных свойств, практическое отсутствие изменчивости. Метод особенно хорош для генетически маркированных штаммов и штаммов продуцентов, не переносящих предварительного замораживания.
Недостатки: Требуется специальный подбор ростовых сред, сред для суспензирования и регенерации клеток после хранения.
       Д) Лиофилизация
Высушивание из замороженного состояния под вакуумом. Этот метод является одним из основных при длительном хранении культур микроорганизмов.
Достоинства: Длительность хранения микроорганизмов данным методом в ряде случаев исчисляется десятками лет. Возможность сохранения большого числа микроорганизмов в достаточно компактном виде (стеклянные ампулы).
Недостатки: Зависимость качества сушки от физиологического состояния культуры перед сушкой. Спорообразующие микроорганизмы значительно лучше хранятся в лиофилизированном виде, чем аспорогенные. Крупноклеточные микроорганизмы, особенно эукариоты, часто бывают чувствительными к лиофилизации и плохо ее переносят. Гибель клеток после лиофилизации часто увеличивается в несколько десятков раз. Успех лиофилизации часто зависит от таксономической принадлежности данных микроорганизмов. В ряде случаев имеет место генетическая изменчивость хранящихся культур, что отрицательно сказывается на сохранности их биологических свойств. При низкой выживаемости культур лиофилизация может оказывать селективное действие, при этом будут отбираться клетки наиболее устойчивых вариантов, которые могут и не обладать желаемыми свойствами. Необходимым условием получения хороших результатов при использовании лиофилизации является подработка методики под каждый конкретный штамм-продуцент.
      Е) Хранение при низких температурах (-200С и -700С) в глицерине.
Этот способ длительного хранения широко используется для консервации фактически всех групп микроорганизмов
Достоинства: Простота, легкость исполнения, высокая надежность сохранения жизнеспособности и биосинтетических свойств культур.
Недостатки: Зависимость от технической надежности низкотемпературных холодильников и электросетей.
      Ж) Хранение при сверхнизких температурах. 
     Универсальный метод длительного хранения, применяемый для всех групп микроорганизмов и культур клеток. Обычно суспензии микроорганизмов в 10%  или 15% глицерине хранят в жидком азоте при температуре  -1960С или в его парах при температуре  -1500С . Данный метод хранения общепризнанно является самым надежным способом консервации любых биоматериалов, включая микроорганизмы. Криоконсервация часто является чуть ли не единственным способом хранения микроорганизмов, которые не переносят ни высушивание, ни лиофилизацию. При замораживании для повышения выживаемости микроорганизмов используют различные виды защитных сред, выполняющих функцию криопротекторов. Криопротекторы бывают двух типов. Одни из них, такие как глицерин или диметилсульфоксид, легко проникают через клеточную мембрану клетки, обеспечивая как внутриклеточную защиту от замораживания, так и внеклеточную. Другие соединения, не проникая внутрь клетки, также оказывают защитное действие против образующихся кристалликов льда на наружной поверхности  клеточной мембраны. К таким криопротекторам относятся, например, декстран, крахмал, сахароза, лактоза и т.д. 
Достоинства: Хранение при низких и сверхнизких температурах фактически не изменяет генетические характеристики культур. Неограниченное время хранения микроорганизмов в неизменном виде.
Недостатки: Необходимость в дорогостоящих кельвинаторах и постоянное пополнение резервуаров жидким азотом.
    Наиболее часто для длительного хранения культур используются методы лиофилизации и криоконсервации. Для обеспечения необходимых условий хранения в ВКПМ используются  специальные хранилища. 
 При поступлении культур в коллекцию в ряде случаев перед депонированием  производится идентификация  штаммов методом 16S. Методика идентификации постоянно подрабатывается. Идентификация по 16S в настоящее время является наиболее быстрым, и точным методом идентификации для большинства прокариот. Суть этого метода заключается в определении нуклеотидной последовательности рибосомальных генов  рРНК, полученную последовательность далее сравнивают с помощью специальных компьютерных программ с другими последовательностями из обширной базы данных, по результатам сравнения делают выводы о принадлежности исследуемой бактерии к тому или иному роду или виду. Такой способ идентификации стал возможен благодаря консервативности этих генов. Существуют и другие, аналогичные методы идентификации по другим консервативным последовательностям ДНК, но отсутствие баз данных по этим генам делают их не  эффективными.
   В общем виде процесс идентификации можно представить следующим  образом.
Для того чтобы провести идентификацию по 16S рРНК, необходимо выполнить следующие действия над исследуемым организмом:
-  рассеять штамм до отдельных колоний
-	нарастить биомассу
-	выделить ДНК
-	провести полимеразную цепную реакцию со специфическими праймерами
-	 очистить полученный фрагмент ДНК
-	 провести секвенирование фрагмента ДНК  для определения нуклеотидной последовательности
-	 проанализировать полученную последовательность в NCBI Blast или рибосомальной базе данных
-	 по результатам анализа отнести организм к тому или иному роду или виду.
	 
	При выделении ДНК для идентификации по последовательностям рибосомальных генов можно пользоваться различными методами выделения ДНК для прокариот или эукариот. Очень важно иметь в своем распоряжении методику, которая позволяет выделять ДНК из различных групп микроорганизмов.
      В ВКПМ были проанализированы и протестированы различные методы выделения ДНК и подобраны и усовершенствованы несколько наиболее универсальных методов.
При помощи этих усовершенствованных методов можно быстро и стабильно выделять небольшие количества ДНК, пригодные для дальнейшего проведения идентификации исследуемых микроорганизмов.
Описание наиболее простого и универсального метода выделения ДНК из клеток бактерий и дрожжей приводится ниже:
1.	Выращивание биомассы клеток.
2.	Центрифугирование полученной биомассы  при скорости 13000 g в течение 5 минут.
3.	Промывание осажденных клеток в 500 микролитрах раствора Tris-EDTA (pH 8)
4.	Добавление к осадку  300 микролитров экстрагирующего буфера и лизоцим (для бактерий)
Состав экстрагирующего буфера:
-	200 mM Tris-HCl (pH 8,5)
-	250 mM NaCl
-	25 mM EDTA
-	0,5 % SDS
5. Инкубирование смеси в течение  5 минут при комнатной температуре
6.	Добавление к смеси 150 микролитров NaAc (pH 5,2). 
7.	Инкубирование при –20о С 10 минут
8.	Центрифугирование в течение 5 минут при скорости 13000g.
9.	Перенесение супернатанта в чистую пробирку и добавление равного объема изопропанола
10.	Центрифугирование в течение 10 минут при скорости 13000g.
11.	Промывание осадка 70% этанолом.
12.	Ресуспендирование  осадка в растворе Tris-EDTA
Обычно признаком хорошего выделения считается чёткая полоса хромосомы на электрофорезе, но в данном случае это желательно, но не принципиально, поскольку ПЦР является очень чувствительным методом, реакция пройдёт даже в том случае, если концентрация ДНК мала или есть примеси.
	После получения нуклеотидной последовательности фрагмента, проводится сравнение его гомологии с уже имеющимися в базе данных. Общепризнанно, что критерием отнесения к виду является гомология не менее 97%.
1.2 Выполнение комплекса  работ по поддержанию и расширению коллекционного       фонда 
Расширение коллекций проводится  путем осуществления различных форм депонирования ценных штаммов, за счет обмена коллекционными культурами с международными коллекциями. За отчетный период из международных коллекций получено более 150 культур.   Основными формами депонирования в ВКПМ являются  депонирование по форме “хранение”, национальное и международное патентное депонирование, депонирование по форме “гарантийное хранение”. Каждая форма депонирования предусматривает различные правила проверки свойств штаммов, распространения информации о штаммах и выдачи коллекционных культур.
Параллельно с  микробиологическими и  генетическими работами в ВКПМ выполняется большой объем работ по обработке информации о коллекционных штаммах.  На каждый коллекционный штамм оформляются стандартные паспорта, содержащие сведения о происхождении штамма, его  генетических особенностях, о промышленно-ценных качествах, свойствах, влияющих  на оценку уровня риска при работе со штаммом и т.д..  Часть паспортных сведений вносится в закрытую и открытую информационно-поисковые базы данных, а также в компьютерный каталог коллекционных  культур.
Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов представляет ряд коллекций, среди которых: 
а) Коллекция промышленно-ценных бактериальных штаммов и коллекция бацилл.
Коллекция промышленно-ценных штаммов  и бациллярная коллекция содержат  4447 штаммов. Эти штаммы предназначены для получения нескольких сот различных промышленно-ценных продуктов и для использования во многих технологических процессах.
     За отчетный период были получены продуценты комплекса биологически активных веществ, спиртов, типовые штаммы, закваски для получения кисломолочных продуктов, продуценты аминокислот, ферментов, органических кислот.
 По запросам организаций выдано 432 штамма, в том  числе  выдано 347 промышленно-ценных штаммов, в том числе 26 - по разрешению депозитора, по правилам Будапештского договора 5  и 54 тест-культур. Это культуры, входящие в закваски кисломолочных продуктов, продуценты ферментов, антибиотиков, органических кислот, спиртов, типовые штаммы и др. 
В коллекцию поступило 246  культур (продуценты пробиотиков,  типовые штаммы, продуценты аминокислот, органических кислот и др. ), из них 145 штаммов депонировано по форме «национальное патентное депонирование», 2 штамма депонировано по форме «международное патентное депонирование»,  59 штаммов - по форме «хранение», 40 штаммов – по форме «гарантийное хранение».
За отчетный период в ходе проведенных плановых проверок жизнеспособности и контролируемых свойств проверено  и перезаложено на длительное хранение 548 культур. 
  Проведена   работа по редактированию и обновлению “Базы данных” и “Каталога  коллекционных  культур”. 
б) Коллекция генетически маркированных бактериальных штаммов и бактериальных плазмид.
В настоящее время в коллекции насчитывается 4651 генетически маркированных штаммов, в том числе более 1000 штаммов содержат плазмиды. Наиболее широко в коллекции представлены различные мутанты E.coli, а также штаммы бактерий родов Bacillus, Azotobacter, Methilobacillus, Pseudomonas, Streptococcus.
Представленные в коллекции штаммы широко используются в генетических и молекулярно-биологических исследованиях. Многие коллекционные штаммы необходимы для проведения современных фундаментальных и прикладных генно-инженерных работ, в том числе для проектов, проводимых в рамках ФЦП. 
В коллекцию входят также бактериальные промышленно-ценные штаммы, полученные генно-инженерными методами, преимущественно продуценты аминокислот и  ферментов.
Плазмидная коллекция содержит более 1000 различных плазмид, находящихся в штаммах-хозяевах, а также в виде ДНК.  
Коллекция генетически маркированных штаммов и плазмид является самой крупной коллекцией из подобных коллекций в России и одной из крупнейших в мире.
За отчетный период проверена жизнеспособность и контролируемые генетические маркеры 266 штаммов. 185 культур после проверки размножено и повторно заложено на длительное хранение в лиофилизированном виде.
В коллекцию поступило 207  культур, это продуценты аминокислот, ферментов, некоторые из них несут плазмиды, сконструированные в отечественных и зарубежных лабораториях и эффективно использующиеся в современных молекулярно-генетических исследованиях,  124 штамма депонировано по форме «национальное патентное депонирование», 82 – по форме «хранение», 1 – по форме «международное депонирование».
Информация о поступивших штаммах внесена в информационную базу данных.
   По запросам  организаций из коллекции выдано 970 штаммов, из них 878 – тест-культур, 91 – генетически маркированных штаммов, 1 – по Будапештскому договору.
  
          в) Коллекция грибов
Всего в коллекции насчитывается 990 культур. Культуры грибов являются продуцентами ферментов, органических кислот, каротиноидов, полиненасыщенных жирных кислот, тест-культурами для проверки грибостойкости различных материалов, антагонистами, применяющимися для биоконтроля фитопатогенных грибов, продуцентами комплекса фитогормонов, использующимися для разработки биоудобрений. В грибной коллекции есть продуценты биологически активных веществ – иммуномодуляторов; продуценты лимонной и глюконовой кислот; продуценты целлюлазы и гемицеллюлазы и др. 
              Проводилась плановая проверка жизнеспособности культур, хранящихся в лиофильно-высушенном виде и под минеральным маслом (есть культуры, которые  погибают при лиофилизации). Проверена жизнеспособность 407 лиофильно-высушенных культур и хранящихся под минеральным маслом на 3-4 различных средах: - из ампул (лиофильно- высушенных)  - 263 штаммов;  хранящихся под вазелиновым маслом – 194 штаммов;  из кельвинатора (-70оС, 10 % глицерин) – 13 штаммов (Blakeslea trispora).
В коллекцию поступило 48  культур, из них 10 штаммов депонировано по форме «национальное патентное депонирование», 28 штаммов - по форме «хранение», 10 штаммов – по форме «гарантийное хранение».
Проводилась  работа по редактированию и обновлению “Базы данных” и  
 “Каталога  коллекционных  культур”. 
За отчетный период по запросам различных организаций выдано 25 тест-культур, 35- для прикладных целей.
г) Коллекция штаммов-продуцентов ферментов нуклеинового обмена и коллекция тест - культур чувствительности к различным антибиотикам.
Коллекция ферментов продуцентов нуклеинового обмена и тест-культур насчитывает 556 культур. Коллекция включает в себя эндонуклеазы рестрикции, ферменты нуклеинового обмена; тест-культуры на антибиотики, аминокислоты, витамины, дезинфицирующие средства и т.д.: 11 штаммов сине-зеленых водорослей, 2 культуры зеленых водорослей.      
За отчетный период в ходе проведенных плановых проверок жизнеспособности и контролируемых свойств проверено 396 культур, в том числе 164 тест-культуры.
По запросам организаций выдано 1233 культуры, из них 1197 – тест-культур, 36 – для прикладных целей.
В коллекцию поступило  30 культур. 16 культур  депонировано по форме  «хранение», 8 – по форме «национальное патентное депонирование»,  6 штаммов – по форме «гарантийное хранение».
Проводилась  работа по редактированию и обновлению “Базы данных” и  
   “Каталога  коллекционных  культур”. 
д) Коллекция дрожжей
Коллекция дрожжей насчитывает 3382 штамма. Среди коллекционных штаммов продуценты нескольких десятков различных промышленно-ценных продуктов и штаммы, применяющиеся в  различных биотехнологических процессах, используемые в медицинской и пищевой промышленности, сельском хозяйстве и других областях. 
Дрожжевая коллекция ВКПМ близка по размеру и составу крупным национальным коллекциям США (АТСС), Германии (DSM), Англии (NCYC), Японии (IFO). В дрожжевой коллекции ВКПМ представлено много уникальных штаммов, предназначенных для использования в различных областях биотехнологии.  Коллекция  дрожжей представляет как научный, так и практический интерес для  поиска продуцентов новых промышленно-ценных веществ. 
  За отчетный период в коллекцию поступили  культуры продуценты органических кислот; для производства пива, природные штаммы.
Проведена плановая проверка жизнеспособности и контролируемых коллекционных свойств и повторная закладка на длительное хранение 438 штаммов дрожжей.
Из коллекции выдано 91 штаммов дрожжей, из них 22 тест-культуры и 69 - для производственных и научных целей.
За отчетный период в коллекцию поступило 124  культуры, из них  23 штамма депонировано по форме «хранение», 33 – по форме  «национальное патентное депонирование»; 68 штаммов – по форме «гарантийное хранение».
Полученные культуры внесены в электронную «Базу данных».
е) Коллекция актиномицетов
Коллекция актиномицетов включает 1784 культуры. Культуры, входящие в состав коллекции, находят широкое применение в практической деятельности человека как продуценты  антибиотиков медицинского и ветеринарного назначения, ферментов, полисахаридов, липидов, нуклеотидов, пигментов, кислот. Представители рода Bifidobacterium используются в качестве  заквасок различных кисломолочных продуктов, продуцентов молочной и уксусной кислот и др. Коллекция включает более 200 типовых штаммов, а также ряд тест-культур для определения активности антибиотиков и др. биологически активных веществ. 
  За отчетный период в коллекцию поступили типовые штаммы,  продуценты антибиотиков, продуценты биологически активных веществ и др.
Все культуры заложены  на хранение и внесены в базу данных. 
Всего получено 47 культур актиномицетов, 36 депонировано по форме «хранение», 11 - по форме  «национальное патентное депонирование».
   Проведена плановая проверка жизнеспособности, чистоты и контролируемых свойств 241 культуры, заложенной на хранение в лиофилизированном виде. Все культуры повторно заложены на хранение.
По запросам различных организаций выдано 82 культуры для прикладных и исследовательских целей.
ж) Коллекция бактериофагов
Фаговая коллекция насчитывает 1091 генетически модифицированных модельных бактериофагов, предназначенных для использования в исследовательских целях, а также набор трансдуцирующих бактериофагов (более 500 штаммов), содержащих фрагменты ДНК, перекрывающие полностью хромосому наиболее хорошо генетически изученного объекта молекулярно-генетических исследований - бактерии E.coli). Помимо этих фагов поддерживается коллекция фагов, специфических более чем для 20 видов промышленно-ценных микроорганизмов (многие из них выделены в процессе фаголиза на производствах). Создана коллекция фагов, специфических  практически ко всем рецепторам E.coli, а также коллекция  бактериальных лизогенов E.coli по различным умеренным фагам. Эти коллекции эффективно используются, в частности, в ходе работ по созданию фагоустойчивых продуцентов на основе E.coli.
В коллекции продолжается работа по распространению нитчатых фагов, используемых в качестве тест - штаммов для санитарно - микробиологического анализа питьевой воды на водопроводных станциях России. 
За отчетный период проведена проверка жизнеспособности и контролируемых свойств 135 бактериофагов, с последующей лиофилизацией и перезакладкой 92 фагов. 
В коллекцию поступил 1 фаг, депонированный по форме «хранение».
Из коллекции выдано 607 тест-культур бактериофагов.
Коллекция гибридом содержит 105 гибридом. 

1.3. Выполнение функций национального и международного органа 
    по        депонированию    микроорганизмов 
В течение всего времени  ВКПМ строго выполняла все правила, установленные для работы ВКПМ в качестве национального и международного патентного депозитария микроорганизмов.
ВКПМ письменно и устно проводила консультации по различным вопросам, 
связанным с депонированием микроорганизмов, в том числе по правовым вопросам, касающимся процедуры депонирования и выдачи штаммов, возможности использования полученных штаммов, а также норм Будапештского договора.
Проводилась работа по выявлению информации о защищенности депонированных штаммов авторскими свидетельствами СССР, патентами России и др. стран. 
              В ходе выполнения проекта в коллекцию обратилось свыше 630 организаций
      В 2007 - 2008 г.г.  ВКПМ  принято 707 штаммов, в том числе 306 культур депонировано по форме «национальное патентное депонирование», 3- «международное патентное депонирование». Проведены плановые выборочные проверки жизнеспособности и контролируемых паспортных свойств  более  2400 коллекционных культур,  подготовлены необходимые  повторные закладки на длительное хранение, В соответствии с действующими правилами распространения коллекционных культур выдано 3500 штаммов, в том числе для реализации ФЦП выдано более 300 коллекционных культур микроорганизмов. Всего в коллекции в настоящее время поддерживается  16887 культур.
Статистические данные приема/выдачи штаммов ВКПМ за все четыре этапа выполнения работы представлены в таблицах 1-3.
Таблица 1    Штаммы, выданные из ВКПМ, депонированные по форме “хранение” 

Использование 	Количество выданных штаммов	
Генетические исследования 	                               115	
Тест- культуры	                             2800	
 Использование в прикладных целях	                              573	

Таблица 2                Штаммы, выданные из ВКПМ, депонированные по форме иной, чем “хранение” 

Форма депонирования	Количество выданных штаммов	Основание  для выдачи	
Национальное патентное	29
	Разрешение депозитора	
Международное патентное	6	Нормы Будапештского договора	
Гарантийное хранение	-	-	

Таблица 3                      Штаммы, поступившие в ВКПМ 

Форма депонирования	Количество штаммов	
Хранение	                                  270	
Национальное патентное депонирование	                                   306                               	
Международное патентное депонирование	                                     3	
Гарантийное хранение	                                  126	

В 2007-2008 г.г. были выполнены разнообразные     сервисные работы для сторонних организаций:
   - были даны около 200 консультаций по работе с коллекционными штаммами, касающимися культивирования микроорганизмов,  различных форм депонирования микроорганизмов;
  - было проведено около 80 работ  по идентификации штаммов  микроорганизмов до вида  с помощью анализа 16S РНК ;   
-  было проведено свыше 30 работ по паспортизации штаммов путем ДНК фингерпринта  микроорганизмов с использованием метода ПЦР; 
- была проведена 1 научно-практическая стажировка аспиранта Кубанского аграрного университета. Целью стажировки являлось освоение практических навыков современных методов по таксономической и штаммовой идентификации микроорганизмов на основе ПЦР, а также теоретических сведений: теоретические основы таксономической идентификации микроорганизмов по последовательностям генов 16S 18S рРНК (бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы), методы выделения суммарной ДНК клетки, электрофореза, ПЦР, анализа первичных последовательностей ДНК с использованием компьютерных программ (Chromas, BLAST, рибосомальной базы данных, применение Vector NTI для этих целей), построение филогенетических деревьев, дополнительное использование других консервативных последовательностей при идентификации близкородственных микроорганизмов, использование ДНК фингерпринта на основе RAPD ПЦР для сравнения
 - постоянно проводятся научно-практические практикумы для студентов  Университета Пищевой биотехнологии, Университета Пищевых производств и Московского государственного университета, с целью последующего прохождения преддипломной практики и подготовкой дипломной работы.
   На базе ВКПМ  проведена работа по подборке условий для длительного хранения 5 штаммов анаэробов (Carboxydothermus, Deferribacter, Geobacter, Fervidococcus, Oscillochrolis); проведена проверка биохимических и культуральных признаков -4 штаммов Enterococcus.
Получено свыше 150 культур из международных коллекций.
          2  Редакция правил  ВКПМ в области обеспечения биобезопасности
    Развитие промышленной  биотехнологии связано  с быстрым увеличением разнообразия штаммов микроорганизмов, используемых в промышленности,  в т.ч. и штаммов  генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов.
     Важная   роль в решении вопросов биобезопасности,  связанной с использованием микроорганизмов, принадлежит коллекции ВКПМ, в которой депонируется большинство промышленных штаммов микроорганизмов.    В задачи ВКПМ  входит не только поддержание стандартных образцов штаммов, предлагаемых для использования в промышленности, но и объективная оценка достоверности всех сведений о штаммах, необходимых для оценки их биобезопасности (включая таксономическое определение), определение уровней биобезопасности, выполнение сервисных работ по проведению идентификации штаммов на уровне ДНК. В целях обеспечения биобезопасности  в ВКПМ введено новое правило - предоставление сведений об идентификации  депонируемых штаммов на уровне ДНК. Это является необходимым условием депонирования  штаммов в коллекции.
     В ВКПМ формируется информационная база данных о всех коллекционных штаммах, включающая информацию об уровнях их биобезопасности и  сведения об опыте их практического использования (включая возможные негативные последствия этого использования). Важной функцией ВКПМ является также анализ нормативной базы, используемой для обеспечения биобезопасности и подготовка предложений по совершенствованию этой нормативной базы. Так  в связи с выходом  в мае 2008 года    новых санитарно-эпидемиологических правил «Безопасность работы с микроорганизмами III-IVгрупп патогенности и возбудителей паразитарных болезней СП 1.3.2322-08» в ВКПМ пересмотрен уровень биобезопасности  96 штаммов, относящихся к роду Enterococcus, которые в соответствии с этими правилами отнесены к 4 группе патогенности. 
  В ВКПМ разработаны новые  правила оценки  уровня риска генетически-модифицированных штаммов, поступающих на депонирование, включающие   проверку достаточности и достоверности свойств, необходимых для оценки уровня риска, правильности определения уровня риска, указанных депозитором, и определяющих необходимый объем дополнительных проверок. 
  Полный текст правил доступен на <genetika.ru> в разделе  «Определение уровня биобезопасности штаммов» и приводится ниже. 
         Настоящие правила определяют порядок определения уровня риска для ГИММ, депонируемых во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов  (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика.
   Настоящие правила разработаны  на основании   Федерального закона РФ « О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности»  с учетом международной практики и  правил работ  с генетически-модифицированными  штаммами  национального института здоровья США (NIH).
При разработке правил использовались следующие документы:
1.Федеральный закон РФ « О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности»
2. Санитарные правила СП 1.2.731-99   Приложение 5.1
3. Правила депонирования в коллекции ВКПМ  <genetika.ru>
NIH Guidelines  http://www4.od.nih.gov
4. U.S. Food and Drug Administration. Center for food safety and applied nutrition http://www.cfsan.fda.gov
5. Закон РФ « О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения»  
 Сокращения, термины, определения, используемые  при разработке правил:                                  
 1). Генно-инженерно-модифицированный микроорганизм (ГИММ) означает микроорганизм,   генетический материал которого был изменен не осуществляемым в природе способом.
2).Физическая защита – создание и использование специальных защитных средств, приемов и устройств, предотвращающих распространение биологических агентов в окружающем пространстве и обеспечивающих биобезопасность при  их использовании. 
3). Биологическая защита-  создание и использование в генетической  инженерии безопасных векторов и клеток- хозяев, биологические свойства которых исключают выживание их в окружающей среде и передачу генетической информации.
4) Векторы - генетические структуры, полученные из ДНК бактериофагов, плазмид, вирусов или иного источника, которые приносят в клетку чужеродную ДНК и обеспечивают репликацию и экспрессию последней в клетке – хозяине.
5). Генетическая инженерия- создание in vitro  биологически активных генетических структур и их введение в клетки микроорганизмов.
6).Клетка - хозяин – клетка, включающая искусственно внесенный генетический материал, состоящий из рекомбинантных ДНК.
7).Рекомбинантные  ДНК – молекулы нуклеиновой кислоты, полученные соединением  in vitro фрагментов ДНК, принадлежащих к разным биологическим видам, в естественных условиях не образующих таких гибридных молекул, которые способны реплицироваться в клетке- хозяине в составе хромосом или в виде автономных структур.
8). Система вектор-хозяин (ВХ) – это живой микроорганизм и введенная в него рекомбинантная молекула ДНК. Система должна рассматриваться как единое целое.
9). Mob. сайт-  ген, ответственный за перенос ДНК от одного микроорганизма  к другому.
10). Gras (generally recognized as safe) статус - этот статут получают микроорганизмы и различные вещества, которые имеют длительную историю безопасного применения в пищевой промышленности США , подтвержденную экспериментальными данными.    
11).  Группы  риска -   это классификация  микроорганизмов по таксономическому признаку, принятая в правилах NIH , основывающаяся  на  таких  факторах, как  вирулентность, патогенность, инфекционная доза, стабильность в окружающей среде, аллергенность,  возможность лечения вакцинами  и.т. д.
12).  Уровень биобезопасности микроорганизма - это  показатель  степени  безопасности  штаммов микроорганизма, учитывающий  группу  риска  микроорганизма,  известные свойства конкретного штамма, определяющие  уровень физической  защиты при работе с данным штаммом и при его распространении.
 13).  Уровень физической защиты -   это комплекс  мер,  необходимых для обеспечения биобезопасности при  работе с ГИММ, предусматривающие уменьшение контакта ГИММ с работающим персоналом, населением  и окружающей средой.
14). Уровень биологической защиты ГИММ – это показатель  способности ГИММ распространяться в природе. Уровень биологической защиты определяют такие факторы, как   выживаемость  ГИММ в окружающей среде,  инфекционность, возможность генетического переноса клонированной ДНК и т.д.  Существуют два уровня в  зависимости от использования  системы вектор – хозяин:    1  (низкий уровень ) или  2 (высокий уровень ).
15).  Уровень биобезопасности ГИММ  -   это  показатель безопасности  ГИММ,  определяемый на основе  группы риска  ( уровня биобезопасности) штамма-хозяина,   уровня   биологической защиты ГИММ, определяющий меры физической защиты, необходимые для работы с ГИММ ( в соответствии с правилами  NIH)
16).  Уровень риска  при работе с ГИММ  (1ый- 4ый)  - это показатель   степени потенциальной опасности, возникающей при осуществлении генно-инженерной деятельности  в соответствии с законом РФ  о генно-инженерной деятельности (соответствует уровням биобезопасности ГИММ по правилам NIH). 
          Постановлением Совета Министров РФ N725-47 от 24.06.96 г   Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ) уполномочена обеспечивать формирование национального  коллекционного фонда промышленно-ценных микроорганизмов, включая генно-инженерно- модифицированные микроорганизмы 1 и 2 ой групп риска  (классификации  NIH Guidelines  http://www4.od.nih.gov).
      Данные правила  работ  с коллекционными  генно-инженерными  штаммами (далее  правила  депонирования ГИММ в ВКПМ)  имеют своей целью ограничить  потенциальную опасность, которую могут представлять ГИММ для здоровья людей и  окружающей среды.  Как и с любыми  микроорганизмами,  работа с ГИММ должна проводиться с учетом биологической безопасности. Общая потенциальная опасность микроорганизма  характеризуется факторами  патогенности и зоопатоненности, токсигенностью,  аллергенностью   и другими факторами,  негативно влияющими на здоровье человека и животных,  включая  мутагенность, канцирогенность,  нейротоксичность. 
        Так как потенциальная опасность ГИММ зависит от свойств клетки - хозяина и привнесенной генетической конструкции, то уровень физической защиты при работе с любыми микроорганизмами должен быть не ниже, чем  при работе с исходным штаммом микроорганизма хозяина. 
  В соответствии с санитарными правилами СП 1.2.011-94     в  Российской Федерации  микроорганизмы (включая вирусы)  классифицируются по уровню их патогенности. 
ВКПМ принимает на депонирование непатогенные микроорганизмы, т.е. микроорганизмы тех видов,  которые не включены   в  списки, приведенные  в санитарных правилах СП 1.2.011-94 , за исключением   штаммов  некоторых  видов  микроорганизмов, отнесенных  к   3 или 4 группе патогенности , но являющихся безопасными для промышленного использования на основании  заключений  о их непатогенности,  выданные уполномоченными  организациями  РФ   или  штаммы, полученные из международных коллекций культур, отнесенные к 1-ой или 2-ой группе биобезопасности  по классификации NIH (Национального института здоровья США) (http://www4.od.nih.gov/Appendix G).
      В международных  коллекциях для безопасной работы со штаммами  всем микроорганизмам присваивается уровень биобезопасности с 1-го по 4-й  в зависимости от группы риска микроорганизма и  конкретных свойств каждого штамма. Уровень биобезопасности определяет  уровень физической защиты при работе с каждым штаммом. 
      Согласно правилам NIH , в соответствии с таксономической идентификацией все микроорганизмы  делятся на   4 группы риска. (http://www4.od.nih.gov/Appendix В).  К первой группе риска относятся микроорганизмы, которые не вызывают заболеваний у человека, ко второй группе риска  относятся микроорганизмы,   редко вызывающие заболевания у человека,   лечение которых не представляет  особых трудностей.
       Для безопасной работы с  микроорганизмами каждой из групп безопасности предусматриваются необходимые меры физической защиты с 1-го (минимальный) по 4-ый (максимальный)  (http://www4.od.nih.gov/Appendix G).  В ВКПМ  для работы с непатогенными микроорганизмами используются   1-й и   2-й уровень физической защиты. 
    1-й уровень (минимальный).
    Эксперименты, требующие физической защиты 1-го уровня, могут проводиться в помещении, предназначенном  для работы с непатогенными микроорганизмами с помощью общепринятых микробиологических методов.  Работа может  проводиться на открытых поверхностях, без специального защитного оборудования, не требуется специальных инженерных устройств. В помещении должна поддерживаться строгая чистота. Приемы и хранение пищи, курение в этом помещении запрещены. В работе следует использовать  только механические пипетки.
    2- уровень (низкий)
    Эксперименты, в которых необходима физическая защита 2-го уровня, могут проводиться в тех же помещениях, что предназначены для работы с 1-м уровнем защиты, но доступ посторонних лиц  ограничивается.  В здании, где расположена  лаборатория, должен быть автоклав. Режим и условия работы приборов, создающих опасность образования  аэрозоля (водоструйные и прочие насосы, лиофилизаторы,  ультразвуковые  дезинтеграторы, качалки и  прочее оборудование) размещаются таким образом, чтобы свести к минимуму поступление частиц аэрозоля в воздух помещения,  используются боксы и ламинарный поток воздуха. Использованные в опыте материалы, содержащие микроорганизмы, обеззараживаются. 
    В международных коллекциях,  в  том числе и американской коллекции АТСС,  существуют 4 уровня биобезопасности  штаммов, определяющих правила обращения с данными микроорганизмом во время работы  или при пересылке их по почте. 
 ВКПМ принимает  на депонирование штаммы из международных коллекций, относящиеся к 1-ому  уровню  биобезопасности (микроорганизмы,  не требующие специальных мер предосторожностей при работе с ними и не представляющие опасности  для здоровья человека) и 2-ому   уровню биобезопасности 
( микроорганизмы,  не требующие специальных мер предосторожностей при работе с ними и которые могут представлять незначительный вред для  здоровья человека).
     В отношении ГИММ    согласно закону РФ « О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности»   в зависимости от степени потенциальной опасности устанавливается четыре уровня риска потенциального воздействия генно-инженерной деятельности на здоровье человека с учетом биологической и физической защиты для замкнутых систем, соответствующие 4-м уровням биобезопасности по правилам NIH (http://www4.od.nih.gov/Appendix G). 
    Все меры  безопасности, снижающие инфекционные свойства ГИММ, уменьшающие их выживаемость в окружающей среде и  устраняющие возможность  генетического переноса,  составляют биологическую защиту. Предусмотрены  два уровня биологической защиты (ВХ-1 и ВХ-2) .  Меры биологической защиты зависят как от свойств микроорганизмов, используемых в качестве хозяина, так и от свойств внесенной генно-инженерной конструкции. При этом должна учитываться как прямая опасность ГИММ, связанная с его способностью вызывать болезни человека, животных, так и косвенная опасность, связанная со способностью ГИММ выживать в окружающей среде и передавать вновь приобретенную генетическую  информацию  в другие организмы. Предусматривается два уровня биологической безопасности  при работе с ГИММ, при этом клетка- хозяин и вектор используются как единая система вектор- хозяин (ВХ). Уровень ВХ-1 - это умеренная безопасность, связанная с незначительным биологическим  загрязнением,  уровень ВХ-2 - высокая безопасность, связанная в высоким уровнем биологического загрязнения.   
       Существуют сертифицированные системы ВХ- 1 и ВХ-2, которые описаны в правилах  национального института здоровья США (NIH) (http://www4.od.nih.gov/, Appendix E). Новые системы ВХ-1 и ВХ-2 должны быть сертифицированы. 
   На основе анализа свойств  клетки - хозяина и  внесенной генетической конструкции, каждому  ГИММ  присваивается  определенный  уровень риска.   ВКПМ как коллекция непатогенных микроорганизмов имеет право работать с ГИММ, которые могут быть отнесены к  I   уровню или ко II  уровню риска (или 1-2 уровню безопасности согласно правилам NIH).
     I уровень риска соответствует работам, которые не представляют опасности для здоровья человека и сопоставим с риском при работе  с непатогенными микроорганизмами.
    II уровень риска соответствует работам, которые представляют незначительную  опасность для здоровья человека и сопоставимы с опасностью при работе с условно- патогенными микроорганизмами.
      Основой для оценки риска является  информация,   приводимая депозитором  в паспорте  штамма ГИММ,  депонируемого в ВКПМ  (форма ВР-1 прил.1.6  паспорт для генетически-модифицированных штаммов ГИММ, приведенный в Правилах  депонирования штаммов в коллекции ВКПМ  <www. genetika.ru>).   В паспорте приводится  заключение комиссии по генно-инженерной деятельности об отнесении штамма к определенной группе риска  (группе биобезопасности по классификации  NIH) c  обязательным обоснованием сделанного заключения на основе критериев, приведенных в  Правилах NIH  (http://www4.od.nih.gov ).  ВКПМ принимает на депонирование штаммы ГИММ,  отнесенные комиссией по генно-инженерной деятельности  к 1 или 2 уровню риска (или 1-2 уровню безопасности согласно правилам NIH) и вправе потребовать  от депозитора  все необходимые сведения  для  уточнения  и проверки    заключения, если в этом возникнет необходимость. 
   Если  депозитор не может предоставить такого заключения, то комиссия  по генно-инженерной деятельности ФГУП ГосНИИгенетики  по представлению  материалов от ВКПМ может рекомендовать  группу риска на основании изучения предложенных материалов от депозитора, но всю полную ответственность за правильность заключения несет депозитор. 
      Подготовка материалов  для  комиссии по генно-инженерной деятельности    начинается с  того, что   делается  заключение:  подпадает ли   данный  ГИММ под  исключения  из  правил, которые регулируют   работу с ГИММ в  NIH.  На основании  накопленных знаний и длительного и безопасного опыта работы  с некоторыми  ГИММ,  ряд генно-инженерных конструкций  исключается из регуляции правилами NIH. ( http://www4.od.nih.gov/, Appendix C).  Если депонируемый ГИММ попадает под действие исключений, ему рекомендуется первый уровень биобезопасности  как при работе с микроорганизмами 1-й группы риска согласно правилам NIH (http://www4.od.nih.gov/Appendix С), работа с которым не  требует специальных мер предосторожностей. Если генетическая конструкция не подпадает под действие исключений, то  следует  внимательно изучить факторы,  определяющие безопасность ГИММ, при этом  учитываются свойства  единой системы  вектор-хозяин и вносимой генетической конструкции.   Институтская комиссия   может  дать заключение о безопасности ГИММ, только если для  конструкции ГИММ использовалась сертифицированная  система  хозяин- вектор в соответствии с правилами  NIH (http://www4.od.nih.gov/Appendix Е), при этом  главное внимание уделяется клонируемому фрагменту ДНК.  Безопасность ДНК  клонируемой ДНК возрастает,   если она имеет минимальные размеры, не содержит рамок считывания с неизвестными функциями, не содержит элементов транспозиции,  не содержит генов, определяющих  токсичность или вирулентность, не увеличивает выживаемость в окружающей среде, нет генов, влияющих на иммунную систему,  нет генов, определяющих синтез аллергенов  и  суперпродукцию ферментов, способных негативно влиять на здоровье человека и окружающую среду,  если все вышеперечисленные свойства можно подтвердить анализом полной нуклеотидной последовательности.
      Если штамм  ГИММ, не подпадающий под действие исключений, создан на основании  не сертифицированной системы  хозяин- вектор, то решение об определении уровня риска  дает межведомственная комиссия  министерства здравоохранения РФ. Возможны  случаи исключений, когда отсутствует сертификация  в использованной системе хозяин-вектор, но известен длительный опыт безопасного использования  штамма-хозяина,  получения им  GRAS  - статуса в соответствии с данными американского центра безопасности питания  (U.S Center for  food  safety and applied nutrition www.cfsan.fda.gov); когда клонированный  фрагмент ДНК из непатогенных микроорганизмов интегрирован в хромосому и отвечает всем перечисленным выше требованиям для  рекомбинантных  ДНК, вектор нетрансмиссивен и не имеет  mob. сайтов, отсутствуют гены устойчивости к антибиотикам, использующимся в медицинских целях. Решение  о присвоении уровня риска   данному штамму ГИММ имеет только институтская комиссия  по генно-инженерной деятельности ФГУП ГосНИИгенетики,  которая в течение двух недель обязана  сообщить свое решение  об  уровне риска штамма ГИММ.
     Риск  работы по получению, хранению, пересылке и использованию ГИММ должен быть адекватно оценен и должны быть использованы соответствующие меры физической и биологической защиты.
       ВКПМ  контролирует правильность заключения  об уровне риска ГИММ на основании предоставляемых сведений. В случае необходимости ВКПМ  может  потребовать от депозитора дополнительных сведений для оценки  уровня риска и высказать обоснованные возражения по результатам оценки уровня риска.
       Граждане РФ   или нерезиденты,  работающие на территории РФ,   предоставившие недостоверную информацию,  на основании которой делается заключение об уровне риска ГИММ и тем самым  допустившие санитарные правонарушения, могут быть привлечены к дисциплинарной, административной и уголовной ответственности   согласно  статье 27 Закона РФ « О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения»  и статье 12 Закона  « О государственном регулировании  в области генно - инженерной деятельности».
     
 3 Обоснование выбора оборудования
А) Анаэробная камера 888-SIMPLICITY/EXP Automatic  Controlled Atmosphere (Anaerobic) фирмы Plas-labs
      В последнее время в ВКПМ возникла потребность в совершенствовании базы для культивирования анаэробных микроорганизмов. Это обусловлено расширением тематики,  в первую очередь активизацией исследований по биотехнологии сольвентогенных клостридиев – продуцентов бутанола, работа  с которыми на современном уровне требует проведения серьезных и длительных генетических и биохимических экспериментов. Кроме того, в коллекции имеется ряд штаммов-анаэробов, надежность поддержания которых также в значительной степени определяется уровнем соответствующего оборудования. Коллекция периодически получает запросы от организаций-заказчиков на культуры практически важных анаэробных бактерий (обитатели рубца жвачных, десульфобактерии и т.д.) и  приобретает их в других коллекциях, причем эти культуры сильно различаются по специфике культивирования (чувствительность к кислороду, потребность в газовых смесях определенного состава, большой диапазон оптимальных для роста температур и т.д.). 
      Современная микробиологическая анаэробная технология основывается на следующих методических принципах:
1). Вся микробиологическая работа с культурами – от пересева до пересева – должна проводиться полностью в анаэробных условиях;
2). Отбор, хранение и обработка проб также должны осуществляться в условиях, не допускающих контакта с молекулярным кислородом;
3). Природные образцы  и чистые культуры  должны высеваться на предварительно восстановленные среды. Термическую стерилизацию сред необходимо проводить в отсутствие молекулярного кислорода, с тем, чтобы в средах не образовывались перекисные соединения и супероксидные радикалы;
4). Ряд биохимических исследований анаэробных микроорганизмов, особенно при изучении их ферментов, коферментов, мембран, должны также выполняться в строго анаэробных условиях. 
       В настоящее время имеется арсенал совершенных методов и оборудования для   культивирования анаэробов как в жидких, так и на плотных питательных средах. В основе этих методов лежат разработки Хангейта, сутью которых являются: 
-  Работа с организмами в токе нейтрального газа или смеси газов, очищенных от кислорода;  - Эффективная очистка газов с помощью высокоэффективных катализаторов реакции кислорода и водорода (гранулированной меди или палладия). 
     Для пересевов и культивирования анаэробов на плотных питательных средах разработаны и выпускаются различными фирмами специальные перчаточные анаэробные боксы и камеры, атмосфера в которых очищается от О2 с помощью палладиевого катализатора, а материалы подаются в камеры с помощью шлюзов.
    К числу наиболее разработанных и эффективных типов анаэробоксов принадлежит модель 888-SIMPLICITY/EXP фирмы Plas-labs. Она отличается компактными размерами (102,5 х 70 х 65 см) и полностью укомплектована для работы. Прибор включает программируемый блок контроля с дисплеем, причем контроль ряда параметров (состав и давление инертного газа, температура и т.д.) после установки осуществляется автоматически. Имеются такие важные блоки и функции, как модуль удаления следов кислорода,  осушительная цепь (вакуумный насос входит в комплект), функции подвода газа и термостатирования камеры до 42оС (что позволяет использовать его и как анаэробный термостат), второй диафрагменный вакуумный насос для шлюзовой камеры, освещение обычным светом и флуоресцентная лампа. В качестве дополнительных,  необходимых для надежной и безопасной работы аксессуаров предлагаются  измеритель и регулятор скорости потока инертного газа, заглушки для отсоединения перчаток и запасные перчатки, вспомогательная система удаления кислорода и  беспламенная горелка-стерилизатор для работы в анаэробных условиях, а также полки, значительно увеличивающие полезную площадь бокса. 
   Преимуществами боксов фирмы Plas-labs, в частности данной модели, могут считаться следующие характеристики:
1. Базовая комплектация включает все необходимое оборудование;
2. Высокая степень автоматизации и надежности узлов, удобный набор дополнительных аксессуаров, расширяющих диапазон возможностей прибора;
3. Дизайн, обеспечивающий компактные размеры в сочетании с большой рабочей поверхностью;
4. Удобная обтекаемая форма прибора позволяет, с одной стороны, эффективно и компактно вписать его в интерьер лаборатории, а с другой стороны,  легко очистить и простерилизовать внутреннюю поверхность;
5. Сравнительно невысокая стоимость для приборов такого класса (у других фирм подобная модель в соответствующей комплектации стоит не менее 950 тыс. руб.);
6. Возможность быстрой пуско-наладки без привлечения сотрудников фирмы, легкость в эксплуатации.  
Б)  Комплекс ферментеров  фирмы «Проинтех»
Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУПГосНИИгенетика обеспечивает формирование  национального коллекционного фонда промышленных микроорганизмов для исследовательских и прикладных целей. В ходе этой работы особое внимание  уделяется   изучению микробных   генетических ресурсов необходимых для работ по приоритетным  направлениям развития  промышленной биотехнологии, таких как  биотехнологическое производство медицинских, пищевых  и кормовых ферментов, органических кислот, антиоксидантов, спиртов. В ходе этих работ, в частности, необходимо  исследование разнообразных  микроорганизмов,  использующихся в ходе  создания высокоэффективных промышленных  продуцентов.  Поскольку  современные промышленные продуценты создаются с использованием  генно-инженерной технологии, необходимо  исследовать эффективность различных генно-инженерных конструкций и разнообразных мутаций, способных  повысить  продуктивность и улучшить технологические свойства промышленных продуцентов. Подобные исследования проводятся в  специальных  лабораторных ферментерах при строго контролируемых  условиях с использованием разнообразных питательных сред и программируемых режимов ферментаций.
Комплекс лабораторных ферментеров позволяет значительно ускорить решение целого ряда задач, стоящих при выполнении биотехнологических проектов, например, быстро провести проверку перспективных штаммов – продуцентов, оптимизировать среды и условия культивирования, включая культивирование в режимах, способствующих максимальной продукции ферментов и продуктов (fed-batch cultivation).
Преимуществами ферментеров данной модели можно считать следующие характеристики:
•	Наличие мешалки с прямым приводом, регулируемым числом оборотов и  специальной формы для перемешивания вязких сред;
•	Имеется пробоотборник  специально для взятия проб с высокой вязкостью;
•	Ферментеры снабжены оригинальной системой уплотнения датчиков, входы совместимы с датчиками фирмы Mettler-Toledo (Ingold Standart); 
•	Управление процессом ферментации производится с клавиатуры персонального компьютера – контроль и поддержание основных параметров ферментации, внесение дополнительного субстрата (подпитки) по различным алгоритмам, в частности, по сигналам от датчика pO2, что позволяет значительно уменьшить расход субстратов;
•	Простота сборки/разборки, быстрая подготовка к работе при соблюдении основных требований и стандартов стерильного культивирования;
•	Сравнительно невысокая стоимость для ферментеров такого уровня (у зарубежных фирм и других отечественных производителей подобный комплекс стоит больше 2 млн. рублей);
•	Возможность быстрого проведения пуско-наладочных работ.
В).  Автоматический автоклав
Основной элемент ферментера выполнен из стекла (так же как и электроды для измерения параметров процесса), что делает этот дорогостоящий прибор хрупким и требует особо бережного обращения при подготовке к эксперименту. Стерилизация – особо важный этап при проведении микробиологических исследований. Стерилизация ферментера должна осуществляться в полностью собранном виде сосуда для культивирования, электродов и обвязки, чтобы исключить возможность контаминации. Полностью собранный ферментер, готовый к стерилизации, весит 7-10 кг. Поэтому место стерилизации и место расположения установки для проведения эксперимента должны находиться на максимально приближенном расстоянии (по крайней мере, на одном этаже). Поэтому, приобретение автоклава является необходимым условием для успешного проведения экспериментов связанных с культивированием в ферментерах.
Оптимальным для данных целей является автоматический автоклав DGM-80 (фирма Pharma Apparate Handel AG, Швейцария). Этот автоклав прост в управлении и, размеры его камеры соответствуют размерам ферментера, имеет широкий спектр стерилизационных программ. Постоянная регулировка давления устраняет воздушные карманы в камере и обеспечивает полную стерилизацию; крышка снабжена автоматической блокировкой  и предохраняет от вскрытия камеры под давлением; дренажная система позволяет освободить резервуар с водой легко и быстро; не требуется подсоединения к системе снабжения. Процесс стерилизации сокращен вдвое за счет быстрого предварительного нагрева камеры. Он значительно дешевле существующих аналогов.
                           
                                                     Заключение
       ВКПМ   выполнила все работы, предусмотренные   планом  проекта «Формирование, сохранение и изучение национального фонда микробных генетических ресурсов на базе УСУ "Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов" (ВКПМ), обеспечивающего проведение исследований по приоритетному направлению "Живые системы». В целях контроля за состоянием коллекции  проведена плановая проверка  жизнеспособности и контролируемых  свойств свыше 2400 коллекционных штаммов.  В коллекцию принято свыше 700 штаммов микроорганизмов, в том числе свыше 300 штаммов принято на национальное патентное депонирование и 3 – на международное патентное депонирование. Полученные культуры представляют интерес для использования в прикладных  и исследовательских целях. Все поступившие  в коллекцию штаммы прошли необходимую проверку и заложены на длительное хранение с использованием   современных технологий лиофилизации и криоконсервации. 
    Бесперебойное функционирование ВКПМ в качестве национальной сервисной коллекции, выполняющей функции национального и международного органа по депонированию,  позволяет обеспечивать сохранность и доступность национального фонда коллекционных промышленно-ценных и генетически-маркированных  штаммов, обеспечивать  возможность  национальной и международной защиты прав интеллектуальной собственности на промышленно-ценные штаммы микроорганизмов. По поводу предоставления штаммов и выполнения различных сервисных исследований в коллекцию обратилось  более 630 организаций. По заявкам потребителей из коллекции выдано 3500 штаммов микроорганизмов, в том числе для реализации ФЦП выдано около 300 коллекционных культур.          
       В ходе реализации проекта ВКПМ была оснащена современным оборудованием и приборами.     Для культивирования анаэробных микроорганизмов получен и активно используется анаэробокс  888-SIMPLICITY/EXP фирмы Plas-labs.  Для значительного ускорения решения целого ряда задач, стоящих при выполнении биотехнологических проектов, проведения проверки перспективных штаммов – продуцентов, оптимизации питательных сред и условий культивирования, включая культивирование в режимах, способствующих максимальной продукции ферментов и продуктов, закуплен комплекс лабораторных ферментеров.  Для выполнения идентификация  штаммов наиболее быстрым и точным методом  16S при поступлении культур в коллекцию также приобретено современное научное оборудование. 
     В ВКПМ сформирована и постоянно обновляется информационная база данных о всех коллекционных штаммах, включающая информацию об уровнях их биобезопасности и  сведения об опыте их практического использования (включая возможные негативные последствия этого использования). Коллекцией постоянно производится анализ нормативной базы, используемой для обеспечения биобезопасности. 
     На основании   Федерального закона РФ « О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности»  с учетом международной практики и  правил работ  с генетически-модифицированными  штаммами  национального института здоровья США (NIH) подготовлена  новая редакция правил  ВКПМ в области обеспечения биобезопасности  правил работ  с генетически-модифицированными  штаммами,   а также разработаны правила депонирования ГИММ в ВКПМ.     Подготовлен электронный каталог коллекционных культур «Каталог ВКПМ-2008».
В будущем планируется  дальнейшее расширение коллекционных фондов ВКПМ; существенное расширение объема работ по осуществлению патентного депонирования, связанное с подготовкой Роспатентом нового положения о национальном   патентном депонировании; увеличение объема  выдачи коллекционных штаммов и спектра сервисных услуг, оказываемых сторонним организациям, связанное с расширением исследовательских работ проводимых в РФ, в частности,  в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы».